尚海巍

(遼寧科技學(xué)院 生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 本溪117004)

逆向工程是通過(guò)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行逆向解析，剖析產(chǎn)品中部分輔料含量的一種方法，它可以有效降低仿制藥開(kāi)發(fā)的難度，縮短分析時(shí)間，為我國(guó)的仿制藥質(zhì)量與療效一致性評(píng)價(jià)提供了一條新思路[1]。

薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯(IPM)都可以作為透皮制劑的促滲劑，對(duì)某些藥物的促滲作用比氮酮還要強(qiáng)[2-3]。二者均可以可逆地改變皮膚結(jié)構(gòu)，降低皮膚對(duì)藥物的阻礙，增加藥物透皮吸收速率從而增加藥物透過(guò)量[4-5]?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的結(jié)構(gòu)示意圖

氟比洛芬(Flurbiprofe, FP)是一種芳基丙酸類非甾體抗炎藥，常用于治療關(guān)節(jié)炎，緩解疼痛[6-7]。氟比洛芬凝膠貼膏具有透皮性能高，吸收起效快，作用時(shí)間長(zhǎng)，副作用小等特點(diǎn)，受到人們的廣泛關(guān)注[8]。目前國(guó)內(nèi)已上市的氟比洛芬凝膠貼膏有得百安和澤普思兩種。經(jīng)查閱，兩種氟比洛芬的市售制劑中均采用薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯作為促滲劑，促進(jìn)氟比洛芬的經(jīng)皮透過(guò)量。為了進(jìn)一步確定市售凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，文章采用“逆向工程”技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了研究。

藥典及相關(guān)文獻(xiàn)都只有單獨(dú)一種促滲劑的含量測(cè)定方法，沒(méi)有同時(shí)測(cè)定兩種化學(xué)促滲劑的方法[9-11]。本文建立了可以同時(shí)測(cè)定薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯含量的方法。通過(guò)測(cè)定市售氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，證明該方法可簡(jiǎn)單，快速，高效的測(cè)定氟比洛芬凝膠貼膏中兩種促滲劑的含量，也為其他透皮制劑中兩種促滲劑含量的同時(shí)測(cè)定提供了方向。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890A氣相色譜儀(FID檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司)、KQ-500E型超聲清洗器(昆山超聲儀器系統(tǒng)有限公司)、ML204T電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 試藥

薄荷醇(安徽銀豐藥業(yè)股份有限公司)、肉豆蔻酸異丙酯(上海凜恩科技發(fā)展有限公司)、水楊酸甲酯(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)、無(wú)水乙醇(色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司)、得百安氟比洛芬凝膠貼膏(北京泰德制藥股份有限公司)、澤普思氟比洛芬凝膠貼膏(北京泰德制藥股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-5毛細(xì)管色譜柱(50 m×320 μm×0.52 μm)；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)；進(jìn)樣口溫度: 230 ℃；檢測(cè)器溫度:240 ℃；分流比：10∶1；進(jìn)樣量：1 μL；程序升溫：初始溫度88 °C, 保持1 min, 以20 °C·min-1的速率升溫至200 °C, 保持7 min, 以10 °C·min-1的速率升溫至220 °C后, 保持10 min。

2.2 溶液的配制

薄荷醇對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制：取10 mg薄荷醇，精密稱定，置100 mL量瓶中，無(wú)水乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.1 mg·mL-1的薄荷醇對(duì)照品儲(chǔ)備液。

肉豆蔻酸異丙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制：取100 mg肉豆蔻酸異丙酯，精密稱定，置100 mL量瓶中，無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1 mg·mL-1的肉豆蔻酸異丙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：取40 mg水楊酸甲酯，精密稱定，置100 mL量瓶中，無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.4 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

混合對(duì)照品溶液的配制：精密移取薄荷醇對(duì)照品儲(chǔ)備液4 mL，肉豆蔻酸異丙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，內(nèi)標(biāo)溶液1 mL置10 mL量瓶中，無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得薄荷醇濃度為0.04 mg·mL-1，肉豆蔻酸異丙酯濃度為0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取2 cm×2 cm的得百安，澤普思氟比洛芬凝膠貼膏，剪碎，置10 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇約5 mL，超聲20 min，放冷，加內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

陰性對(duì)照溶液的制備：取不加薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的氟比洛芬凝膠貼膏2 cm×2 cm，剪碎，置至10 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇5 mL，超聲20 min，放冷，加內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，作為陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性

取“2.2 溶液配制”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.1 色譜條件”進(jìn)行分析，各峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000，拖尾因子在0.95 ～ 1.05之間。另取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣六次，計(jì)算薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD值分別為0.7%和0.6%，表明系統(tǒng)適用性良好。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性

取“2.2 溶液的配制”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、無(wú)水乙醇，按“2.1 色譜條件”進(jìn)行分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液中的薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的色譜峰與對(duì)照品有相同的保留時(shí)間，無(wú)水乙醇、陰性對(duì)照溶液對(duì)供試品中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量測(cè)定沒(méi)有影響。各溶液的色譜圖如圖2所示。

2.4.2 線性與范圍

精密移取薄荷醇對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、6 mL、8 mL，肉豆蔻酸異丙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL，內(nèi)標(biāo)溶液1 mL置同一個(gè)10 mL量瓶中，無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得薄荷醇濃度為0.01 mg·mL-1、

圖2 供試品溶液(A)和混合對(duì)照品溶液(B)的氣相色譜圖

0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1，肉豆蔻酸異丙酯濃度為0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1的系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1 色譜條件”進(jìn)行分析，以濃度C對(duì)薄荷醇、肉豆蔻酸異丙酯峰面積與內(nèi)標(biāo)溶液峰面積的比值A(chǔ)進(jìn)行線性回歸，得到薄荷醇的線性回歸方程：A= 41.018C-0.035處5(r=0.999)，肉豆蔻酸異丙酯的線性回歸方程：A= 33.049C+0.726 8(r=0.999)。結(jié)果表明，薄荷醇在0.01 mg·mL-1～ 0.08mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性，肉豆蔻酸異丙酯在0.02 mg·mL-1～ 0.2 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性。

2.4.3 重復(fù)性

取同一批次的得百安，澤普思氟比洛芬凝膠貼膏，按照“2.2 溶液的配制”項(xiàng)下供試品溶液配制方法，平行配制六份，按“2.1 色譜條件”進(jìn)行分析。得百安，澤普思氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇含量的RSD分別為6.1%，5.1%，肉豆蔻酸異丙酯含量的RSD分別為9.4%，7.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性

取同一批次的得百安、澤普思氟比洛芬凝膠貼膏，按照“2.2 溶液的配制”項(xiàng)下供試品溶液配制方法，配制成供試品溶液，室溫放置，分別于 0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。薄荷醇，肉豆蔻酸異丙酯與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值RSD值分別為0.4%，0.6%，表明供試品溶液在室溫下放置10 h穩(wěn)定。

2.4.5 回收率

取同一批次制作的陰性對(duì)照溶液1 mL，精密量取，置10 mL量瓶中(共9份)，作為本底。分別移取0.1 mg·mL-1的薄荷醇對(duì)照品溶液2.4 mL、3 mL、3.6 mL，1 mg·mL-1濃度的肉豆蔻酸異丙酯對(duì)照品溶液0.8 mL，1 mL，1.2 mL，內(nèi)標(biāo)溶液1 mL各三份置于上述9個(gè)10 mL量瓶中，無(wú)水乙醇稀釋至刻度搖勻，即得80%(L)、100%(M)、120%(H)的準(zhǔn)確度溶液。將這9個(gè)樣品按“2.1 色譜條件”分別進(jìn)行分析，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示，薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的平均回收率分別為100.5%和101.7%，RSD分別為0.8%和1.1%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.5 含量測(cè)定

取同一批次的得百安、澤普思氟比洛芬凝膠貼膏，按照“2.2 溶液的配制”項(xiàng)下供試品溶液配制方法，平行配制六份，按“2.1 色譜條件”進(jìn)行分析。用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算兩種市售氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，結(jié)果如表2所示。

表2 不同氟比洛芬凝膠貼膏市售制劑中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量測(cè)定結(jié)果(Mean±SD n=6)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

查閱相關(guān)數(shù)據(jù)得知，薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的沸點(diǎn)相差23 °C，采用以極性和沸點(diǎn)作為分離基礎(chǔ)的色譜柱更容易分離[12]。內(nèi)標(biāo)法可以避免由于操作條件等變化所引起的誤差，測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確。水楊酸甲酯不會(huì)對(duì)薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量測(cè)定造成影響，且位于薄荷醇色譜峰附近[13]。因此選用水楊酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物。通過(guò)調(diào)整柱溫升溫的速率和保持時(shí)間，改善薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯色譜峰的分離效果，最終確定初始溫度88 °C, 保持1 min, 以20 °C·min-1的速率升溫至200 °C, 保持7 min, 以10 °C·min-1的速率升溫至220 °C后, 保持10 min為最佳程序升溫條件。

3.2 含量測(cè)定結(jié)果分析

由含量測(cè)定結(jié)果可知，得百安與澤普思氟比洛芬凝膠貼膏兩種市售制劑中所含的薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯含量不存在顯著性差異(P>0.05)。兩種市售制劑中薄荷醇的含量是15.57 mg/貼～18.27 mg/貼，肉豆蔻酸異丙酯的含量是33.60 mg/貼～42.70 mg/貼。文章所建立的揮發(fā)性成分的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠、操作方便，適用于測(cè)定氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，可以為凝膠貼膏的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

4 結(jié)論

文章建立了得百安，澤普思氟比洛芬凝膠貼膏中揮發(fā)性成分(薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯)“逆向工程”分析方法。結(jié)果表明，該方法可以簡(jiǎn)便、快速、高效地測(cè)定氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，且兩者市售制劑中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量不存在顯著性差異(P>0.05)。