吳輝淵 鄧蘭 李芬芬

治療耐藥性是臨床腫瘤學(xué)面臨的最大挑戰(zhàn)之一［1］,惡性腫瘤復(fù)發(fā)源于耐藥性腫瘤細(xì)胞能夠重新填充腫瘤生態(tài)位并播種新的病變,這些細(xì)胞被稱為癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs),CSCs 具有腫瘤原始特性、干細(xì)胞性和侵襲性,其重要特征之一是高醛脫氫酶1A1(aldehyde dehydrogenas 1A1,ALDH1A1) 表達(dá)［2］。ALDH1A1 主要存在于腫瘤干細(xì)胞表面及胞漿,作為CSCs 標(biāo)志物,表達(dá)水平越高患者預(yù)后越差,與ALDH1A1 相關(guān)的抑制CSCs 增殖和耐藥的抗癌治療逐漸受到重視,目前尚無以ALDH1A1 為靶點的藥物上市［3］。NCT-501 對 ALDH1A1 具有較高的選擇性抑制作用,是目前ALDH1A1 活性研究中常用的陽性對照藥［4］。中藥活性成分以種類多樣、結(jié)構(gòu)獨特、生物活性高等特點,在抗腫瘤領(lǐng)域具有突出的優(yōu)勢。本研究利用類藥性篩選,分子對接,分子動力學(xué)模擬等一系列技術(shù),從中藥化合物庫篩選出潛在的ALDH1A1 抑制劑活性物質(zhì),提供后續(xù)臨床及藥物研究的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究采用Ledock 軟件進(jìn)行分子對接工作。ADME 預(yù)測采用SwissADME 在線工具,分子動力學(xué)模擬使用AMBER 18 軟件進(jìn)行。

實驗儀器與試劑：ALDH1A1 重組蛋白購于上海澤葉生物科技有限公司,血竭素(Cochinchinenin)購于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；NCT-501 購于上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司,酶標(biāo)儀為Spark 10 M 型,氧化型輔酶1(NAD),二甲基亞砜、乙醛均購于美國sigma,其他試劑均為國藥分析純。

1.2 靶蛋白ALDH1A1 結(jié)構(gòu)預(yù)處理 虛擬篩選使用的ALDH1A1 蛋白晶體結(jié)構(gòu)從PDB 數(shù)據(jù)庫［5］中下載獲得,PDB ID 為4WPN；在對接開始之前,使用對接軟件中的Lepro 模塊對受體蛋白進(jìn)行處理,包括去除水分子、鹽離子以及小分子等操作。準(zhǔn)備靶標(biāo)ALDH1A1蛋白活性口袋并產(chǎn)生格點文件,原結(jié)晶配體坐標(biāo)作為格點盒子中心。4WPN 晶體結(jié)構(gòu)中蛋白與小分子抑制劑CM053 結(jié)合模式及關(guān)鍵殘基見圖1。

圖1 4WPN 結(jié)合模式及關(guān)鍵殘基

1.3 中藥分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的預(yù)處理 配體小分子庫含17580 個常見的天然產(chǎn)物分子,該數(shù)據(jù)庫從陶術(shù)生物官方(https://www.tsbiochem.com/natural-products)獲取。使用Openbabel 2.4.1 對其進(jìn)行2D 至3D 格式轉(zhuǎn)換工作。

1.4 類藥性評估 基于類藥性規(guī)則“Lipinski Ro5”對中藥分子配體庫進(jìn)行首輪篩選,篩選出10965 個符合類藥性規(guī)則的命中分子。Lipinski Ro5 篩選規(guī)則［6］：分子量(MW)：500～700 Da,化合物的油水分配系數(shù)的對數(shù)值(clog P)=0～7.5,氫鍵供體(HBD)≤5,氫鍵受體(HBA)≤10,拓?fù)錁O性表面積(TPSA)≤200 ?2,可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量(NRB)≤20。

1.5 分子對接 設(shè)置對接盒子,使用PyMol 插件center_of_mass.py 基于活性位點的位置定義對接盒子的中心(37.33,16.60,14.42),盒子邊長設(shè)定為18 ?。設(shè)定每個分子對接輸出最大構(gòu)象數(shù)為3 個,其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。輸出的打分最高的對接構(gòu)象被我們認(rèn)為是結(jié)合構(gòu)象,選取Score＜-10 kcal/mol 分子。

1.6 ADME 預(yù)測 基于ADME 藥動學(xué)參數(shù),采用SwissADME 在線工具對Score＜-10 kcal/mol 分子進(jìn)行ADME 預(yù)測。從MW、HBD、HBA、脂水分配系數(shù)(lipid-water partition coefficient)、可旋轉(zhuǎn)鍵(rotatable bonds)、生物利用度(bioavailability)、TPSA、腦血管障壁(blood-Brain Barrier,BBB)、P-糖蛋白(P-gp)、水溶性ESOL Log S 等評估,篩選具有良好類藥性質(zhì)的化合物。

1.7 分子動力學(xué)模擬 基于上述對接獲得的小分子與蛋白復(fù)合物作為初始結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行全原子分子動力學(xué)模擬,模擬使用AMBER 18 軟件進(jìn)行。模擬之前,用antechamber 模塊和gaussian 09 軟件的 HF/6-31G*計算中藥分子的電荷。之后,中藥分子采用GAFF2 力場［7］,ALDH1A1 采用蛋白力場ff14SB［8］。各體系均采用LEaP 模塊給體系添加氫原子,在體系10 ? 距離處添加截斷的八面體TIP3P 溶劑盒,并在體系中添加Na+/Cl-用于平衡體系電荷,最后輸出用于模擬的拓?fù)浜蛥?shù)文件。

分子動力學(xué)模擬采用AMBER 18 軟件。在模擬之前,對體系進(jìn)行能量優(yōu)化,包括2500 步的共軛梯度法和2500 步的最速下降法。能量最小化后,在恒定升溫速度和固定體積條件下,在200 ps 內(nèi)使體系溫度緩慢加熱到298.15 K。維持298.15 K 的體系溫度,500 ps的nvt 系綜的平衡模擬,使溶劑盒子中的溶劑分子更均勻分布。然后,對平衡后的體系在NPT 條件下模擬500 ps。最后在周期邊界性條件下分別對兩個復(fù)合體系進(jìn)行100 ns 的NPT 系綜模擬。模擬時,設(shè)置10 ? 為非鍵的截斷距離,運用Particle mesh Ewald 方法計算長程的靜電作用［9］,限制氫原子鍵長的方法選用SHAKE,溫控用Langevin 算法［10］,其中積分步長為2 fs,體系壓強為1 atm(1 atm=1.01×105Pa),碰撞頻率γ 設(shè)為2 ps-1,每10 ps 保存軌跡數(shù)據(jù)用于進(jìn)一步分析。

1.8 MM/GBSA 結(jié)合自由能計算 所有體系的蛋白和配體間的結(jié)合自由能通過MM/GBSA 方法計算［11-13］。本研究中采用45～50 ns 的分子動力學(xué)模擬軌跡用作計算,具體公式如下。

其中,△Einternal表示內(nèi)能、△EVDW表示范德華作用以及△Eelec表示靜電相互作用。內(nèi)能包括扭轉(zhuǎn)能(Etorsion)、角能(Eangle)、和鍵能(Ebond),△GGB和△GGA統(tǒng)稱溶劑化自由能。其中,GGB 為極性溶劑化自由能、GSA 為非極性溶劑化自由能?！鱃GB采用Nguyen［14］研究的GB 模型計算(igb=2)?！鱃SA 則采用表面張力(γ)與溶劑可及性表面積(surface area,SA)相乘得到,△GSA=0.0072×△SASA。

1.9 酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗 乙醛脫氫酶1 的測試方法：通過測定波長340 nm 處吸光度值每分鐘的變化,可計算出每分鐘NAD+轉(zhuǎn)化為還原型輔酶1(NADH)的量,從而得到該酶的酶活。定義每分鐘波長340 nm 處吸光度值上升1 為1 個活力單位(U)。將5 μl 濃度為150 nM ALDH1a1 加入測定孔中,反應(yīng)體系在25℃,包括1 mM EDTA,2 mM NAD+,0.1 M 磷酸緩沖溶液(pH=7.4)加入測定孔,最后加入250 μM 乙醛開始反應(yīng),并開始記錄光密度(OD)值的變化,總體系反應(yīng)時間為5 min,反應(yīng)體系為300 μl。酶活性為△OD/min,重復(fù)試驗組3 次。

2 結(jié)果

2.1 虛擬篩選流程及結(jié)果 對接模擬技術(shù)是探究小分子與目標(biāo)靶點相互作用的便捷有效手段?；诖?本研究針對ALDH1A1 蛋白的活性位點,使用ledock 軟件對常見的天然產(chǎn)物分子進(jìn)行基于對接的虛擬篩選研究。中藥分子庫中共有17580 個中藥單體化合物,進(jìn)行多輪虛擬篩選,見圖2。通過分子對接,篩選出排名前10 的命中分子,見表1。進(jìn)一步ADME 預(yù)測,見表2。根據(jù)MM/GBSA 結(jié)合自由能,選取排名前4 的分子進(jìn)一步做分子動力學(xué)模擬。見圖3。四個中藥化合物的名稱為血竭素(Cochinchinenin)、波棱酮(Herpetone)、2,3 二氫橡膠樹雙黃酮(2,3-Dihydroheveaflavone)、蘇鐵雙黃酮(Sotetsuflavone),對接軟件對以上化合物的結(jié)合能打分分別為-10.692、-10.309、-10.359、-10.611 kcal/mol。

圖2 虛擬篩選流程

表1 分子對接(排名前10)

表2 ADME 參數(shù)預(yù)測(排名前4)

圖3 基于虛擬篩選獲得的4 個潛在的ALDH1A1 抑制分子

2.2 結(jié)合模式分析 基于上述虛擬篩選對接輸出的Cochinchinenin、Herpetone、2,3-Dihydroheveaflavone、Sotetsuflavone 與ALDH1A1 蛋白的復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合模式分析。見圖4。小分子2,3-Dihydroheveaflavone、Sotetsuflavone、Cochinchinenin、Herpetone 與ALDH1A1蛋白的結(jié)合模式：小分子2,3-Dihydroheveaflavone 與蛋白上的SER-461、TRP-178、THR-129、PHE-171、HIS-293 形成氫鍵作用,還和蛋白上的PHE-171 形成疏水作用。見圖4A。小分子Sotetsuflavone 和蛋白上的SER-461、THR-129、TRP-178、TRP-297、HIS-293形成氫鍵作用,和LYS-128、VAL-174、ILE-304 形成疏水作用。此外,Sotetsuflavone 和ALDH1A1 蛋白上的TYR-297、PHE-171 還形成pipi-共軛作用。見圖4B。對于Cochinchinenin/ALDH1A1 復(fù)合物,兩者主要通過氫鍵作用、疏水作用、pipi-共軛作用發(fā)生結(jié)合。例如小分子Cochinchinenin 和ALDH1A1 蛋白上的TRP-178、GLY-125、ASN-121、GLU-269、TYR-297 形成氫鍵作用,和ALA-462、TRP-128、LYS128、VAL-174、PHE-171、TYR-297、ILE-304、VAL-460、PHE-466 形成疏水作用。此外,小分子Cochinchinenin 還和蛋白上的PHE-171 形成pipi-共軛作用。見圖4C。對于Herpetone/ALDH1A1 復(fù)合物,小分子Herpetone 和蛋白上的TRP-178、THR-129、ASN-121 形成氫鍵作用,和VAL-174、TYR-297、PHE-290 發(fā)生疏水作用,和TYR-297、HIS-293 形成pipi-共軛作用。見圖4D。進(jìn)一步,對上述四組復(fù)合物進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,來分析這些復(fù)合物的結(jié)合穩(wěn)定性以及更為精確的結(jié)合能。

圖4 基于對接獲得的小分子2,3-Dihydroheveaflavone、Sotetsuflavone、Cochinchinenin、Herpetone 與ALDH1A1 蛋白的結(jié)合模式,左圖為整體視圖,右圖為局部視圖,圖中藍(lán)色stick 為小分子,淡青色Cartoon 為蛋白,氫鍵作用以黃色虛線顯示,疏水作用以灰色虛線顯示,pipi-共軛作用以綠色虛線顯示

2.3 穩(wěn)定性分析 分子動力學(xué)模擬的均方根偏(RMSD)可以反映復(fù)合物的運動過程,RMSD 越大以及波動越劇烈表示運動劇烈,反之運動平穩(wěn)。見圖5。ALDH1A1 蛋白在未結(jié)合藥物的情況下(黑線)模擬過程中波動程度大,而結(jié)合了藥物后波動程度呈現(xiàn)更穩(wěn)定的趨勢,尤其是在ALDH1A1/TNP-004802、ALDH1A1/TNP-000924 復(fù)合物,它們在分子動力學(xué)模擬過程中RMSD 基本上在3 ? 以內(nèi)穩(wěn)定波動。暗示ALDH1A1/TNP-004802、ALDH1A1/TNP-000924 復(fù)合物結(jié)合非常穩(wěn)定。

圖5 分子動力學(xué)模擬過程中復(fù)合物RMSD 差隨時間的變化

均方根波動(RMSF)可以反映分子動力學(xué)模擬的過程中蛋白的柔性。通常藥物結(jié)合蛋白后,蛋白柔性下降,進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)定蛋白的作用,發(fā)揮酶活效果。除了蛋白兩端以及130～145 段氨基酸外,其余各個序列段的RMSF 數(shù)值偏低,表示整個結(jié)構(gòu)的柔性較低。對比結(jié)合化合物和未結(jié)合化合物蛋白的RMSF 數(shù)值,發(fā)現(xiàn)結(jié)合化合物時,蛋白的RMSF 更低,其中結(jié)合TNP-004802最顯著,其次為TBB-02884、TNP-000924、TNP-001406。見圖6。

圖6 基于分子動力學(xué)模擬軌跡計算的RMSF

2.4 MM/GBSA 結(jié)果 在本研究中基于MM/GBSA 計算方法,對分子動力學(xué)模擬軌跡充分采樣以準(zhǔn)確計算小分子與蛋白的結(jié)合能。ALDH1A1 蛋白和TBB-02884、TNP-001406、TNP-004802、TNP-000924 的結(jié)合能分別為(-36.35±3.70)、(-43.61±2.32)、(-56.66±3.83)、(-52.26±2.64) kcal/mol。四個組合的結(jié)合能都非常高,其中ALDH1A1 蛋白和TNP-004802、TNP-000924 的結(jié)合能甚至＞-50.0 kcal/mol,暗示其結(jié)合較好。通過殘基分解,四個組合結(jié)合的主要貢獻(xiàn)力為疏水作用,其次是靜電作用,最后是非極性溶劑化自由能。見表3。

表3 MM/GBSA 計算結(jié)合自由能(,kcal/mol)

表3 MM/GBSA 計算結(jié)合自由能(,kcal/mol)

ΔEvdW: 范德瓦耳斯能量(van der Waals energy)；ΔEelec: 靜電能量(electrostatic energy)；ΔGGB: 靜電對溶劑化的貢獻(xiàn)(electrostatic contribution to solvation)；ΔGSA: 溶劑化的非極性貢獻(xiàn)(non-polar contribution to solvation)；ΔGbind: 結(jié)合自由能(binding free energy)

ALDH1A1 上的氨基酸類型對該結(jié)合起重要作用,對理解結(jié)合機制也非常重要,將4 個候選分子與ALDH1A1 結(jié)合的能量分解至每個殘基的貢獻(xiàn)。復(fù)合物中對結(jié)合能起貢獻(xiàn)的Top-10 氨基酸：對于ALDH1A1/TBB-02884 復(fù)合物,ILE 304、PHE 289、PHE 170、ASN 121、TRP 178、TYR 297、VAL 460、TYR 457、CYS 302、VAL 459 為關(guān)鍵性氨基酸；對于ALDH1A1/TNP-001406 復(fù)合物,TRP 178、TYR 297、VAL 460、ASN 121、PHE 171、ILE 304、SER 461、GLY 125、LYS 128、ALA 462 為結(jié)合貢獻(xiàn)大的氨基酸；對于ALDH1A1/TNP-004802 復(fù)合物,TRP 178、ILE 304、VAL 174、TYR 457、VAL 460、PHE 171、TYR 297、CYS 302、ASN 121、SER 461 為結(jié)合貢獻(xiàn)大的氨基酸；對于TNP-000924 復(fù)合物,TYR 297、GLY 125、ALA 462、VAL 460、TRP 178、PHE 290、VAL 459、SER 461、GLN 463、VAL 174 為結(jié)合貢獻(xiàn)大的氨基酸。見圖7。

圖7 對小分子和蛋白結(jié)合能起貢獻(xiàn)的Top-10 氨基酸

2.5 氫鍵分析 氫鍵作用是小分子化合物和蛋白結(jié)合過程中最強的非共價作用之一,在分子動力學(xué)模擬期間,統(tǒng)計各個復(fù)合物形成的氫鍵情況：小分子TBB-02884、TNP-001406、TNP-004802、TNP-000924 和ALDH1A1 蛋白在模擬過程中形成的氫鍵數(shù)目都維持在2 個以上。表明氫鍵作用對四個復(fù)合物穩(wěn)定存在起重要作用。TNP-001406、TNP-000924 在模擬過程中和ALDH1A1 蛋白形成的氫鍵頻率要高于TBB-02884、TNP-004802,意味著TNP-001406、TNP-000924 和ALDH1A1 蛋白的結(jié)合更加依賴于氫鍵作用。見圖8。

圖8 分子動力模擬過程中小分子與蛋白的氫鍵數(shù)目變化

2.6 酶活抑制實驗結(jié)果 TNP-004802 與ALDH1A1結(jié)合穩(wěn)定,且結(jié)合能最高,進(jìn)一步運用酶動力學(xué)實驗方法比較TNP-004802 與NCT-501 對ALDH1A1 的抑制活性,結(jié)果顯示,兩者均有較好的抑制活性,低濃度的TNP-004802 抑制活性高于NCT-501。見圖9。

圖9 TNP-004802 與NCT-501 對ALDH1A1 的抑制活性

3 討論

醛脫氫酶(ALDHs)是一類依賴于NAD(P)的酶,可催化醛氧化成羧酸。ALDHs 是四聚體酶,N 端的結(jié)合域與輔因子 NAD+結(jié)合,從而改變四聚體構(gòu)象［15］。催化位點的亞基結(jié)構(gòu)形成結(jié)合口袋與乙醛等底物結(jié)合后發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,這種相對柔性的結(jié)構(gòu)改變是限制醛氧化的關(guān)鍵步驟［16］。人體中,已知有19 種功能性基因編碼ALDHs 的基因［17］。視黃醛的主要催化酶是ALDH1A1。目前分離到的多種CSCs 發(fā)現(xiàn)ALDH1A1表達(dá)水平升高［18］,聯(lián)合CD133、CXCR4、Notch-4 等標(biāo)志物用于分離和鑒定CSCs。因此,ALDH1A1 可作為抗腫瘤治療的重要靶標(biāo),研發(fā) ALDH1A1 抑制劑是目前腫瘤治療領(lǐng)域的熱點,目前已發(fā)現(xiàn)多種不同結(jié)構(gòu)的抑制劑,未來研究方向?qū)⒅饕谙葘?dǎo)化合物的優(yōu)化。許多腫瘤細(xì)胞系以及患者中ALDH1A1 酶水平升高導(dǎo)致對化療和放療的耐藥［19］。

ALDHs 抑制劑雙硫侖適合從腫瘤中根除化學(xué)抗性干細(xì)胞樣腫瘤起始細(xì)胞和預(yù)防復(fù)發(fā)的治療方法［20］。Omran［21］開發(fā)了雙硫侖衍生物2b 顯示出與雙硫侖對ALDH1A1 相當(dāng)?shù)幕钚浴erma 等［22］通過三維定量構(gòu)效關(guān)系和骨架躍遷設(shè)計了21 種ALDH1A1 抑制劑,全部化合物均顯示半抑制濃度(IC50)值在0.02～0.80 μM的范圍內(nèi),表明這些作為環(huán)磷酰胺耐藥的輔助治療的潛力。研究表明［23］,乙醛脫氫酶1 的催化活性中心主要為半胱氨酸-302(Cys302),已報道的抑制劑主要通過與Cys302 結(jié)合導(dǎo)致酶的催化活性受抑制。本研究對17580 個中藥分子進(jìn)行Lipinski Ro5 規(guī)則、分子對接、ADME 預(yù)測,選取了4 個化合物進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,Cochinchinenin、Herpetone、2,3-Dihydroheveaflavone、Sotetsuflavone。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cochinchinenin 與ALDH1A1的Cys302、TRP 178 等多個氨基酸殘基位點結(jié)合,穩(wěn)定性最顯著,結(jié)合能最高,酶活抑制實驗顯示了其對ALDH1A1 良好的抑制活性。

Cochinchinenin 是來源于中藥血竭的化合物,《唐本草》論及血竭的功效為“主五臟邪氣,帶下,止痛,破積血,金創(chuàng)生肉”,常用于跌打損傷、惡瘡、瘰疬等。血竭一直以來用于惡性腫瘤的治療,明代龔?fù)①t所著《萬病回春·積聚》提及含血竭的藥方”神化丹”之功效：“消癖積、破血塊、下鬼胎、通經(jīng)脈及諸痞積血氣塊”。現(xiàn)代臨床應(yīng)用單味血竭粉外敷、內(nèi)服治療癌性潰瘍108 例,取得滿意療效［24］,外敷可用于癌性疼痛［25］,實驗研究方面,血竭素高氯酸鹽通過降低細(xì)胞線粒體膜電位,誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 凋亡［26］；通過活化MAPK 通路中的JNK 和p38 發(fā)揮促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LU251 凋亡的作用［27］。

本研究虛擬篩選血竭素作為ALDH1A1 抑制劑,具有抑制腫瘤干細(xì)胞增殖和耐藥的可能藥效,血竭素可作為先導(dǎo)化合物研究,進(jìn)一步可開展藥物化學(xué)、藥理學(xué)及臨床研究,找到與ALDH1A1 相關(guān)的抑制癌癥干細(xì)胞增殖和耐藥的有效藥物。