胡月

流感病毒屬于正黏病毒科,依據(jù)其外膜血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白抗原性不同,目前可分為若干個(gè)亞型(H1～H16,N1～N9)［1］,H1N1 是感染人的最主要甲型流感病毒,是臨床上最常見(jiàn)的引起上呼吸道感染的流感病毒株,臨床上表現(xiàn)為突發(fā)高熱、咳嗽、咽痛、流涕或鼻塞、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)痛、全身不適等多種流感樣癥狀,影響患者的工作和生活［2］。目前,流感疫苗仍是最主要的流感預(yù)防措施,但因?yàn)榱鞲胁《驹诓粩嘧儺?存在疫苗的研究和生產(chǎn)跟不上病毒變異速度的問(wèn)題［3］。西藥抗病毒毒副作用大,特異性低,易于產(chǎn)生耐藥。中醫(yī)藥防治流感病毒臨床診治經(jīng)驗(yàn)豐富,療效確切,毒副作用低,患者接受度高。本研究委托中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所,以利巴韋林為陽(yáng)性對(duì)照,在MDCK 細(xì)胞水平上,評(píng)價(jià)兒童清咽解熱口服液對(duì)H1N1及H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑

1.1.1.1 受試藥物 兒童清咽解熱口服液,由亞寶藥業(yè)四川制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)171041。

1.1.1.2 對(duì)照藥物 利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品,購(gòu)置于大連美侖生物科技有限公司,批號(hào)20160518。

1.1.1.3 試劑和儀器 ①試劑：DMEM 培養(yǎng)基(Life Science: Cat.No.12800-17,Lot No.1837973)、FBS(Biological Industry: Cat.No.04-001-1ACS-500 ml,Lot No.1837973)、青-鏈霉素(碧云天：Cat.No.ST488,配置成200000 U/ml)、DMEM 完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+100 U/ml PS)、RPMI1640 完全培養(yǎng)基(RPMI1640+10%FBS+100 U/ml PS)、磷酸鹽緩沖液(1000 ml ddH2O中加入NaCl 8.1816 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 3.58 g,KH2PO40.24 g,攪拌溶解,調(diào)pH 至7.3)、胰酶(Trypsin)、CellTiter GloTM(Promega,貨號(hào)：G7572,Lot No.0000158064)。②儀器及實(shí)驗(yàn)環(huán)境：二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo)、生物安全柜(哈東聯(lián))、酶標(biāo)儀(PerkinElmer,型號(hào)Envision)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Bio-Rad,型號(hào)TC10TM)、倒置顯微鏡(Zeiss Observer,型號(hào)A1)、高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀(PerkinElmer HCS)。

1.1.2 細(xì)胞與病毒 細(xì)胞：MDCK 來(lái)源于中國(guó)病毒保藏中心,從美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)購(gòu)置,本實(shí)驗(yàn)室傳代保存為P8～P11 代。培養(yǎng)條件：DMEM+10%FBS、37℃、5% CO2。H1N1 病毒：A 型流感病毒(H1N1,A/PuertoRico/8/1934),該批次病毒編號(hào)為20161102NS。H1N1 奧司他韋耐藥病毒株：來(lái)源于中國(guó)病毒保藏中心,由本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增保存。

1.2 方法

1.2.1 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)采用CellTiter-GloTM熒光法檢測(cè)受試藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。將MDCK 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,細(xì)胞貼壁后備用。兒童清咽解熱口服液和利巴韋林用DMEM 培養(yǎng)基從2 倍最高測(cè)試濃度起連續(xù)3 倍梯度稀釋8 個(gè)梯度,再將不同濃度的藥物及適量培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中,于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入不同濃度兒童清咽解熱口服液或利巴韋林培養(yǎng)22 h 后,顯微鏡下觀察藥物引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),并加入CellTiter-Glo 檢測(cè)細(xì)胞存活率。藥物對(duì)細(xì)胞的毒性以細(xì)胞的活性表示。計(jì)算公式：細(xì)胞活性(%)=(熒光值藥物組-熒光值空白對(duì)照)/(熒光值細(xì)胞對(duì)照-熒光值空白對(duì)照)×100。

利用Graphpad Prism 作圖并計(jì)算CC50和CC0.1。其中CC50通過(guò)軟件中的計(jì)算公式log(inhibitor) vs.normalized response-Variable slope 計(jì)算得出,而CC0.1通過(guò)軟件中的計(jì)算公式log(agonist) vs.response -Find ECanything 計(jì)算得出。

1.2.2 病毒毒力的測(cè)定(TCID50) 將H1N1 和H1N1奧司他韋耐藥病毒株連續(xù)10 倍遞次稀釋為l0-1～10-8后,將各稀釋度的病毒接種于MDCK 細(xì)胞中,每個(gè)稀釋度4 孔,于37℃吸附1 h 后換用維持液繼續(xù)培養(yǎng),設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照孔和病毒對(duì)照孔。72 h 后,取細(xì)胞培養(yǎng)液上清測(cè)定血凝素(HA),并用Reed-Muench 法計(jì)算各病毒的TCID50。

1.2.3 抗病毒活性評(píng)價(jià) 將100 TCID50的H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥病毒株與藥物同時(shí)加入細(xì)胞中,各組均為2 個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置不加藥物的病毒對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組。各組細(xì)胞于37℃培養(yǎng)22 h,采用間接免疫熒光的方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中病毒復(fù)制水平,實(shí)驗(yàn)采用流感病毒NP 蛋白的單克隆抗體特異性結(jié)合NP 蛋白,之后用熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗,檢測(cè)熒光信號(hào)的數(shù)量及強(qiáng)度。通過(guò)熒光信號(hào)的數(shù)量判斷病毒復(fù)制的水平,觀察兒童清咽解熱口服液和利巴韋林對(duì)H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株病毒增殖的影響。抑制率(%)=100-(樣品孔數(shù)值-空白對(duì)照數(shù)值)/(病毒對(duì)照數(shù)值-空白對(duì)照數(shù)值)×100,利用Graphpad Prism 6 作圖并計(jì)算

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性測(cè)定 在MDCK 細(xì)胞上,兒童清咽解熱口服液的CC0.1為0.85 mg/ml,利巴韋林的CC0.1＞73.26 μg/ml。見(jiàn) 表1,表2。CellTiter-GloTM免 疫熒光法測(cè)定結(jié)果與CPE 法一致。采用Graphpad Prism作圖計(jì)算兒童清咽解熱口服液的CC50為44.97 mg/ml。

表1 CPE 法觀察藥物對(duì)MDCK 細(xì)胞最大無(wú)毒濃度

表2 CellTiter-GloTM 免疫熒光法測(cè)定不同藥物濃度作用的細(xì)胞活性及培養(yǎng)上清OD 值()

表2 CellTiter-GloTM 免疫熒光法測(cè)定不同藥物濃度作用的細(xì)胞活性及培養(yǎng)上清OD 值()

注：細(xì)胞對(duì)照組OD 值為(1004118.33±55369.80)

2.2 病毒毒力測(cè)定結(jié)果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用CellTiter-GloTM免疫熒光法計(jì)算H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株的TCID50值分別為107.83/ml 和108.0/ml,本實(shí)驗(yàn)采用病毒量為100 TCID50。

2.3 兒童清咽解熱口服液抗病毒活性評(píng)價(jià)

2.3.1 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1、H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的效果 在MDCK 細(xì)胞上采用藥物和病毒同時(shí)加入的方式觀察藥物的抗病毒作用,37℃培養(yǎng)22 h 后培養(yǎng)液上清中高內(nèi)涵熒光OD 值和抑制率見(jiàn)表3,表4。兒童清咽解熱口服液OD 值明顯低于病毒對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明兒童清咽解熱口服液有較好的抗H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒作用。

表3 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 流感病毒效果()

表3 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 流感病毒效果()

注：病毒對(duì)照組OD 值為(11697.25±4586.81)

表4 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒效果()

表4 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒效果()

注：病毒對(duì)照組OD 值為(7553.75±1182.54)

2.3.2 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 的EC50和SI 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 的EC50為2.70 mg/ml,SI 為16.66,兒童清咽解熱口服液和利巴韋林對(duì)流感病毒H1N1 的抑制作用和對(duì)MDCK 細(xì)胞的毒性結(jié)果見(jiàn)圖1,表5。

表5 兒童清咽解熱口服液對(duì)流感病毒H1N1 的抑制作用和對(duì)細(xì)胞的毒性作用

圖1 兒童清咽解熱口服液和利巴韋林對(duì)H1N1 病毒的抑制作用和對(duì)細(xì)胞的毒性作用

2.3.3 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的EC50和SI 兒童清咽解熱口服液體外抗H1N1奧司他韋耐藥株流感病毒的EC50為2.29 mg/ml,SI 為19.63,兒童清咽解熱口服液和利巴韋林對(duì)流感病毒H1N1 奧司他韋耐藥株的具體抑制作用和對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性結(jié)果見(jiàn)圖2,表6。

表6 兒童清咽解熱口服液對(duì)流感病毒H1N1 奧司他韋耐藥株的抑制作用和對(duì)細(xì)胞的毒性作用

圖2 兒童清咽解熱口服液對(duì)H1N1 奧司他韋耐藥株病毒的抑制作用和對(duì)細(xì)胞的毒性作用

3 討論

兒童清咽解熱口服液主要成分為柴胡、黃芩苷、紫花地丁、人工牛黃、苣荬菜、魚(yú)腥草、蘆根和赤小豆,具有清熱解毒,消腫利咽的功效。小兒急性咽炎(急喉痹)屬肺胃實(shí)熱證,癥見(jiàn)：發(fā)熱,咽痛,咽部充血,或咳嗽,口渴等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)兒童清咽解熱口服液具有抗炎、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用［5-8］。臨床上將其用于小兒急性咽炎的治療,對(duì)小兒急性咽炎咽痛、大便干、咽紅腫等癥狀有明顯的改善作用,而且經(jīng)濟(jì)性好［9-12］。

本研究探討了兒童清咽解熱口服液采用中和的給藥方式對(duì)H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的抑制作用。研究通過(guò)CPE 和CellTiter-GloTM免疫熒光檢測(cè)方法觀察兒童清咽解熱口服液對(duì)病毒感染細(xì)胞的保護(hù)作用。相較于傳統(tǒng)細(xì)胞毒測(cè)定方法,CellTiter-GloTM免疫熒光法檢測(cè)效率更高,更為可靠。CellTiter-GloTM免疫熒光法通過(guò)對(duì)三磷酸腺苷(ATP)進(jìn)行定量測(cè)定來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目。有代謝活性細(xì)胞的呼吸作用和其他生命活動(dòng)過(guò)程可以產(chǎn)生ATP,而發(fā)光過(guò)程中熒光素酶需要ATP 的參與,活的細(xì)胞就形成穩(wěn)定輝光型信號(hào),并在高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀被檢測(cè)到?？共《净钚詸z測(cè)通過(guò)采用間接免疫熒光的方法測(cè)定流感病毒蛋白表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)病毒的復(fù)制水平。實(shí)驗(yàn)采用流感病毒NP 蛋白的單克隆抗體特異性結(jié)合NP 蛋白,之后用熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗,檢測(cè)熒光信號(hào)的數(shù)量及強(qiáng)度,病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)水平與病毒的復(fù)制水平呈正比,因此可以通過(guò)熒光信號(hào)的數(shù)量判斷病毒復(fù)制的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兒童清咽解熱口服液采用中和給藥方式對(duì)H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒均有顯著抑制作用。兒童清咽解熱口服液CC50為44.97 mg/ml,對(duì)H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥株流感病毒的EC50分別為2.70、2.29 mg/ml,在H1N1 和H1N1奧司他韋耐藥株上的SI 分別為16.66 和19.63。一般認(rèn)為SI＞1 時(shí),藥物具有低毒高活性［4］,結(jié)果顯示兒童清咽解熱口服液具有體外抗H1N1 和H1N1 奧司他韋耐藥病毒株的作用,顯示出較好的安全性及有效性。

急性咽炎是急性上呼吸道感染的一種,急性上呼吸道感染是指鼻腔、咽或喉部急性炎癥的總稱,亦常用“感冒”、“鼻炎”、“急性鼻咽炎”、“急性咽炎”、“急性扁桃體炎”等名詞診斷,統(tǒng)稱為上呼吸道感染,是小兒最常見(jiàn)的急性感染性疾病。急性呼吸道感染的病原體以病毒為主,占90%以上,常見(jiàn)病毒包括鼻病毒、柯薩奇病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒。非典型病原體在呼吸道感染中所占比例也呈逐漸升高趨勢(shì),其中肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌等。常見(jiàn)細(xì)菌僅為原發(fā)性上呼吸道感染的10%左右,病原菌以β 溶血性鏈球菌、肺炎球菌、流感嗜血桿菌和葡萄球菌等為主。本項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)兒童清咽解熱口服液不僅對(duì)引起急性上呼吸道感染的常見(jiàn)病毒株H1N1 有效,還對(duì)奧司他韋耐藥H1N1 病毒株有效,為兒童清咽解熱口服液臨床上治療小兒上呼吸道病毒感染性疾病提供了啟示和指導(dǎo)。