楊驍，姜承瀚，孫博，谷鐵軍，萬明明，孫捷，丁雪，王岑嶸，周恩同，姜皓，蘇維恒

1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院艾滋病疫苗國家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130012；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝園林系，吉林 延邊朝鮮族自治州 133002；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手術(shù)室，吉林 長春 130033

水痘和帶狀皰疹是全球范圍內(nèi)廣泛流行的兩種疾病，均由水痘?帶狀皰疹病毒（varicella?zorter virus，VZV）引起［1］。VZV 是一種雙鏈DNA 病毒，該病毒在人群中通過接觸飛沫感染，通常初次感染于兒童時(shí)期，臨床表現(xiàn)為水痘。水痘患者痊愈后，病毒會潛伏于患者神經(jīng)節(jié)中，并有一定幾率重新激活，導(dǎo)致帶狀皰疹。該疾病會導(dǎo)致不同程度的皰疹后神經(jīng)痛，并且可能引起較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致死亡［2］。

疫苗是防控VZV 的最好手段之一。自20 世紀(jì)60年代以來，基于細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗逐漸成為病毒性疫苗的主要生產(chǎn)方式?？捎糜谝呙缟a(chǎn)的細(xì)胞系包括原代細(xì)胞系（地鼠腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞）、二倍體細(xì)胞系（人二倍體細(xì)胞、猴二倍體細(xì)胞）、傳代細(xì)胞系（Vero細(xì)胞等）。目前常見的VZV 疫苗包括美國Merck 公司的 Varivax 和 Zostavax 以及英國 GSK 的 Varilrix等［3］?；谌硕扼w細(xì)胞的生產(chǎn)模式，在安全性上優(yōu)勢明顯，特別在去除疫苗中宿主細(xì)胞的DNA 污染上［4?5］。如 1995年批準(zhǔn)上市的針對水痘的減毒活疫苗Varivax（Merck）和2006年批準(zhǔn)上市的針對帶狀皰疹的減毒活疫苗Zostavax（Merck）均使用人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)［6?7］。但人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)難度較大，疫苗產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本較高，造成疫苗價(jià)格昂貴，在發(fā)展中國家發(fā)展緩慢難以普及［8?9］。面對人二倍體細(xì)胞在疫苗生產(chǎn)中的困境，一些病毒疫苗選擇使用非洲綠猴腎Vero 細(xì)胞生產(chǎn)，雖然增加了疫苗因非人DNA污染帶來的安全隱患，但大幅提高了疫苗產(chǎn)量。如狂犬病病毒在Vero細(xì)胞中的復(fù)制水平較人二倍體細(xì)胞MRC?5高10倍左右［10］；流感病毒在Vero細(xì)胞中的復(fù)制水平也顯著高于人二倍體細(xì)胞［11］。但對于VZV，由于Vero細(xì)胞VZV受體的缺失，無法使用Vero細(xì)胞提高其疫苗產(chǎn)量，人二倍體細(xì)胞成為重要的VZV 減毒活疫苗生產(chǎn)細(xì)胞系。因此，探索病毒在人二倍體細(xì)胞中復(fù)制水平低的原因，尋找合適的方法提高病毒在人二倍體細(xì)胞中的復(fù)制水平，增加疫苗尤其是VZV減毒活疫苗產(chǎn)量，成為急需解決的問題。

1957年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常重要的細(xì)胞因子——干擾素（interferon，IFN），不僅具有直接抗病毒作用，還具有免疫增強(qiáng)作用［12?14］。IFN 應(yīng)答作為重要的先天免疫途徑，主要通過識別病毒的特定特征而被激活，最終產(chǎn)生抗病毒因子，達(dá)到清除病毒的目的。病毒進(jìn)入機(jī)體后，其不同于宿主的特點(diǎn)如雙鏈RNA、三磷酸末端的 RNA、逆轉(zhuǎn)錄RNA 和CpG 被特定模式識別受體識別，激活I(lǐng)FNα／β表達(dá)［15］。IFNα／β分泌并被周邊細(xì)胞的IFN 受體識別，激活細(xì)胞內(nèi)部的IFN 信號傳導(dǎo)，最終誘導(dǎo)產(chǎn)生如蛋白激酶RNA（protein kinase RNA，PKR）、2'，5'?寡腺苷酸合成酶1（2'，5'?oligoadenylate synthetase 1，OAS1）等病毒剪切因子［16?17］。通過細(xì)胞吞噬、病毒基因組剪切等方式，清除病毒［18?20］。IFN 應(yīng)答的抗病毒機(jī)制抵御病毒入侵的同時(shí)，也成為基于細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗發(fā)展的障礙。

如果克服了人二倍體細(xì)胞病毒疫苗產(chǎn)量低、價(jià)格高的劣勢，將對我國基于人二倍體細(xì)胞病毒疫苗發(fā)展意義重大。本研究通過CRISPR／Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建 IFN 受體 1（interferon receptor 1，IFNAR1）沉默的 MRC?5 細(xì)胞系（MRC?5IFNAR1?），利用其提高VZV 的復(fù)制水平，為基于 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系的疫苗生產(chǎn)模式奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及質(zhì)粒 人胚肺成纖維細(xì)胞MRC?5、非洲綠猴腎Vero 細(xì)胞購自ATCC（American Type Culture Collection）；VZV 減毒活病毒疫苗原液（voka株，病毒滴度為105PFU／mL）由長春百克生物科技股份公司提供，于-80 ℃保存；質(zhì)粒PX458、PX458?gRNA購自美國Addgene公司。

1.2 主要試劑及儀器 1%胎牛血清購自美國Gibco公司；RNAprep pure 細(xì)胞總RNA 提取試劑盒購自中國 TIANGEN 公司 ；MiniBEST Viral RNA Extraction Kit、qPCR 試劑盒購自中國 TaKaRa Bio 公司；PCR 操作系統(tǒng)CFX96購自美國Bio?Rad公司。

1.3 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系的構(gòu)建 通過對 MRC?5 細(xì)胞基因組IFNAR1（Gene ID：3454）區(qū)的分析，使用遺傳擾動平臺（Genetic Perturbation Platform，GPP）網(wǎng)絡(luò)工具設(shè)計(jì)靶向的gRNA，并通過CRISPR 分析工具（CRISPR Analysis Tool，CAT）評估gRNA的切割效率。將gRNA克隆至含Cas9 蛋白序列的PX458 質(zhì)粒中（克隆位點(diǎn)在U6啟動子之后），電轉(zhuǎn)（680 V）入MRC?5細(xì)胞，設(shè)原始細(xì)胞對照（MRC?5）組和PX458 空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)對照（MRC?5NC）組；電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞接種96 孔板，0.8個(gè)／孔，用含10%胎牛血清、1%青霉素?鏈霉素和1%L?谷氨酰胺的MEM 培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)7~10 d，每3 d 更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中添加嘌呤霉素（0.6 μg／mL）。通過Sanger 測序（由庫美生物科技有限公司完成）鑒定同基因敲除細(xì)胞克隆。測序結(jié)果中產(chǎn)生突變的MRC?5細(xì)胞被分離并傳代最終形成3株原始的MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系。細(xì)胞系穩(wěn)定傳代5 次后，用RNAprep pure 細(xì)胞總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總內(nèi)源性mRNA，利用IFNAR1引物qRT?PCR法檢測IFNAR1mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1，引物由庫美生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，循環(huán)40次；60 ℃ 30 s。所有反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并使用2-△△Ct法量化。

1.4 MRC?5細(xì)胞的感染 將MRC?5或MRC?5IFNAR1?細(xì)胞接種6孔板，1.3 × 106個(gè)／孔，按0.1 MOI感染VZV，于32 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h；無血清MEM 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，用含1%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。感染后24 和168 h 收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，于-80 ℃保存。設(shè)原始細(xì)胞對照組（MRC?5和MRC?5IFNAR1?組），病毒感染組（MRC?5+和MRC?5IFNAR1?+組）。

1.5 VZV感染MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系對IFN應(yīng)答水平影響的檢測 用RNAprep pure 細(xì)胞總RNA 提取試劑盒提取感染后24 h細(xì)胞總mRNA，利用IFNβ和OAS1引物qRT?PCR法檢測IFN應(yīng)答因子IFNβ和OAS1mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1，反應(yīng)條件同1.3項(xiàng)。

1.6 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系對 VZV 基因組復(fù)制水平影響的檢測 利用MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取病毒感染168 h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒DNA，利用 VZVORF62引物 qRT?PCR 法檢測病毒 DNA 拷貝數(shù)。引物序列見表1，反應(yīng)條件同1.3項(xiàng)。

表1 qRT?PCR引物Tab.1 Primers for qRT?PCR

1.7 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系對 VZV 子代病毒滴度影響的檢測 采用空斑形成單位（plaque formation unit，PFU）試驗(yàn)。將病毒感染168 h 后細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)10倍梯度稀釋后，感染Vero 細(xì)胞，37 ℃，5%CO2條件下吸附4 h 后，覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散，通過統(tǒng)計(jì)空斑計(jì)算病毒滴度（PFU／mL）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Prism 9 軟件單向方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IFNAR1沉默的 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系的鑒定MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系連續(xù)傳 5 代后，對IFNAR1基因的測序結(jié)果顯示，MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系含有穩(wěn)定的移碼突變，突變位點(diǎn)發(fā)生在IFNAR1IFNβ 結(jié)合域，這些移碼突變是IFNAR1徹底沉默的前提條件，見圖1。MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系IFNAR1mRNA相對表達(dá)量為MRC?5細(xì)胞的27%（t=24.50，P<0.01），為MRC?5NC細(xì)胞的24%（t=28.33，P<0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。表明MRC?5IFNAR1?產(chǎn)生了IFNAR1基因的移碼突變，并直接影響細(xì)胞內(nèi)IFNAR1mRNA 的相對表達(dá)量，證明了MRC?5IFNAR1?的穩(wěn)定性。

圖1 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系測序Fig.1 Sequencing of MRC?5IFNAR1?cell line

圖2 IFNAR1 mRNA相對表達(dá)量的qRT?PCR檢測Fig.2 Determination of relative expression of IFNAR1 mRNA by qRT?PCR

2.2 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系生長狀態(tài)觀察 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系在細(xì)胞生長速度、細(xì)胞形態(tài)等方面與MRC?5細(xì)胞無明顯差別，見圖3。細(xì)胞傳代至50 代左右，出現(xiàn)貼壁困難、生長緩慢、細(xì)胞代謝物增多、細(xì)胞死亡等現(xiàn)象。表明MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系極限代次與MRC?5細(xì)胞一致，IFNAR1基因沉默對 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系的正常傳代無明顯影響。

圖3 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系生長狀態(tài)的顯微鏡觀察Fig.3 Microscopy of growth state of MRC?5IFNAR1?cell line

2.3 VZV 感染 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系對 IFN 應(yīng)答水平的影響 VZV 感染后24 h，與MRC?5組相比，MRC?5+組 IFN 應(yīng)答水平顯著增加，IFNβ和OAS1mRNA 相對表達(dá)量分別增加了92 和133 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為16.28和66.78，P均<0.01），見圖4。同時(shí)VZV感染后24 h，與MRC?5+組相比，MRC?5IFNAR1?+組IFN應(yīng)答水平顯著降低，IFNβ和OAS1mRNA相對表達(dá)量分別降低了61%和90%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為18.82 和 16.75，P均<0.01），見圖4。表明MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系有效沉默了病毒感染引起的IFN應(yīng)答。

圖4 病毒感染后 24 h MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系 IFN 相關(guān)基因相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of IFN related genes in MRC?5IFNAR1?cell line 24 h after virus infection

2.4 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系對 VZV 基因組復(fù)制水平的影響 VZV 感染后168 h，與MRC?5+組（2 600）相比，MRC?5IFNAR1?+組中VZV DNA 拷貝數(shù)（14 912）增加 5.7倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 10.51，P <0.01）。表明MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系 IFN 應(yīng)答水平的降低有效增加了病毒在MRC?5細(xì)胞中的DNA復(fù)制水平。

2.5 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系對 VZV 子代病毒滴度的影響 VZV 感染后 168 h，與 MRC?5+細(xì)胞組相比（47 500 PFU／mL），MRC?5IFNAR1?+細(xì)胞組培養(yǎng)上清中VZV 病毒滴度（207 500 PFU／mL）增加4.3 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 20.24，P <0.01）。表明IFNAR1沉默引起的低IFN 應(yīng)答水平，提高了VZV 在MRC?5細(xì)胞中的產(chǎn)量。

3 討 論

近年來，基于細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗成為全球預(yù)防病毒感染的最有效方法之一［21］。可以用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系很多，其中基于Vero 細(xì)胞生產(chǎn)的滅活病毒疫苗存在非人源DNA 污染物的安全問題。導(dǎo)致這種疫苗產(chǎn)品對質(zhì)量控制中殘留的DNA 要求極高［22］。對更安全疫苗的需求使采用人二倍體細(xì)胞如MRC?5細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的策略意義重大［23］。但大多數(shù)病毒在人二倍體細(xì)胞中復(fù)制水平較低，THOULOUZE 等［24］報(bào)道了狂犬病病毒對二倍體細(xì)胞的感染效率僅為Vero細(xì)胞的30%。目前市售的VZV 疫苗多采用人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)。研究表明，VZV 在MRC?5 細(xì)胞中的復(fù)制水平僅為 Vero 細(xì)胞的 1／5［25］。這導(dǎo)致疫苗成本高、產(chǎn)量低，在發(fā)展中國家的發(fā)展受到一定程度的制約。因此，如何提高病毒在人二倍體細(xì)胞中的復(fù)制水平，成為基于細(xì)胞生產(chǎn)的病毒疫苗的研究熱點(diǎn)之一。

通過比較Vero 和MRC?5 細(xì)胞的不同，關(guān)注點(diǎn)集中到 IFN 應(yīng)答系統(tǒng)上［26，12］。IFN 應(yīng)答作為先天免疫系統(tǒng)重要的組成部分，其中Ⅰ型IFN 主要被病毒感染激活，行使抗病毒功能。其主要特點(diǎn)為對病毒識別的廣譜性和抗病毒因子快速產(chǎn)生。IFN 應(yīng)答的抗病毒作用可能在人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)疫苗過程中變成阻礙，尤其是對一些感染早期病毒復(fù)制水平較低的病毒，如VZV 和甲型肝炎病毒（HAV）。通過抑制IFN應(yīng)答的手段，提高這些病毒在人二倍體細(xì)胞中復(fù)制水平的研究較多。如 2003年，YOUNG 等［27］闡明了IFN 無應(yīng)答細(xì)胞在疫苗開發(fā)和制造中的實(shí)際應(yīng)用。2014年，STEWART 等［28］同樣通過使用 IFN 抑制劑的方法增加了呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）在人二倍體細(xì)胞中的復(fù)制能力。HAMA?MOTO 等［11］通過使用 siRNA 沉默IRF7基因表達(dá)來增加MDCK 細(xì)胞中流感病毒的產(chǎn)量。使用抑制IFN應(yīng)答手段提高VZV在人二倍體細(xì)胞中的復(fù)制水平研究較少，多數(shù)增加VZV 復(fù)制水平的研究僅關(guān)注毒種的篩選和病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化［29?30］。但這些研究對于病毒復(fù)制水平的提高有限，因此，本研究采用抑制IFN 應(yīng)答的方式來提高 VZV 在 MRC?5 細(xì)胞中的復(fù)制水平。

在對抑制IFN 應(yīng)答手段的選擇中，本研究面向生產(chǎn)考慮到傳統(tǒng)IFN 抑制劑和siRNA 在生產(chǎn)應(yīng)用中的缺陷，這些外源物質(zhì)的加入難以在疫苗后續(xù)生產(chǎn)過程中去除，增加了質(zhì)量控制的難度，并且將作為成本的一部分提高了疫苗價(jià)格。因此，本研究重點(diǎn)探討IFN應(yīng)答沉默MRC?5細(xì)胞系對病毒復(fù)制的影響。

本研究使用CRISPR／Cas9 編輯技術(shù)成功構(gòu)建了IFNAR1沉默的 MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系。結(jié)果顯示，CRISPR／Cas9編輯后IFNAR1基因發(fā)生了移碼突變，且IFNAR1mRNA 相對表達(dá)量顯著降低。這種降低可能是由無意義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense?mediated mRNA decay，NMD）或無終止密碼子引起的mRNA降解（no?stop decay，NSD）導(dǎo)致的［31?33］。病毒感染后MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系 IFN 應(yīng)答水平顯著降低，VZV 在MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系中的 DNA 復(fù)制水平和子代病毒滴度均顯著增加。這些結(jié)果均證明了MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系對 IFN 應(yīng)答的有效沉默，提高了 VZV 在 MRC?5 細(xì)胞中的復(fù)制水平，為人二倍體細(xì)胞在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了新的思路。

MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系的成功建立，解決了多種病毒在MRC?5細(xì)胞中產(chǎn)量低的問題。與同類研究抑制IFN 的方法如 IFN 抑制劑、siRNA 比較，減少了二次污染，使用方法更為簡單。MRC?5IFNAR1?細(xì)胞系不需要改變傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)方法，明顯節(jié)約了生產(chǎn)工藝的研發(fā)時(shí)間和成本，降低了質(zhì)檢檢測壓力。本研究為改進(jìn)基于MRC?5細(xì)胞制備的病毒疫苗提供了新的思路和策略。