孫京京，黃建東

中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，廣東 深圳 518055

細菌外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV）是革蘭陰性菌生長過程中分泌的球形顆粒，直徑為20 ~ 250 nm，表面攜帶母體菌的外膜成分，如膜蛋白、脂多糖等，內(nèi)部包裹細菌蛋白質(zhì)、核酸等［1］。由于OMV 表面含有病原相關(guān)分子模式，可激活免疫系統(tǒng)，具有作為疫苗載體的潛力。目前，采用腦膜炎球菌OMV 生產(chǎn)的疫苗已應(yīng)用于B 群流行性腦脊髓膜炎的預(yù)防［2］。近年，有研究將OMV 作為載體用于遞送核酸、藥物等［3］，還將 OMV 作為抗原呈遞平臺，經(jīng)外膜蛋白將異源蛋白呈遞于OMV 表面，從而遞送至機體內(nèi)，并獲得了較好的免疫效果［4］。目前的研究常用溶血素A（cytolysin A，ClyA）、外膜蛋白A（outer membrane protein A，OmpA）、外膜蛋白 W（outer membrane protein W，OmpW）等膜蛋白與抗原融合表達，將抗原定位至 OMV 表面［5?6］。質(zhì)譜研究證實，OMV 表面還攜帶其他外膜蛋白，如外膜蛋白C（outer membrane protein C，OmpC）［7］，以O(shè)mpC 作為蛋白呈遞平臺將抗原定位至細菌OMV 表面的相關(guān)研究較少。因此，本研究將金黃色葡萄球菌EsxA抗原基因（esxA基因）與ompC基因進行重組，并經(jīng)原核細胞表達融合蛋白，高速離心法提取重組菌OMV，采用福流納米流式儀檢測OMV 表面的融合蛋白，探討OmpC 作為蛋白呈遞平臺將抗原定位至OMV表面的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株、基因及載體 感受態(tài)E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）均購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；ompC基因片段及esxA基因均由深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院制備，載體pET21a由該研究院保存。

1.2 主要試劑及儀器 內(nèi)切酶SalⅠ、HindⅢ及T4 DNA連接酶均購自英國NEW ENGLAND BioLabs公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒及PrimeSTAR Max DNA Polymerase 均購自日本 TaKaRa 公司；One Step Cloning試劑盒購自南京諾維贊生物科技股份有限公司；小鼠抗His?Tag單克隆抗體及HRP標記的山羊抗小鼠IgG 均購自美國Proteintech Group 公司；Al?exa Fluor 488 偶聯(lián)抗體購自美國 Abcam 公司；LB 培養(yǎng)基及IPTG 均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ECL 發(fā)光液、超濾管（100 KDa）、0.45 μm 濾膜及PVDF膜均購自美國Millipore公司；SDS?PAGE蛋白上樣緩沖液（5 ×）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；福流納米流式儀購自廈門福流生物科技有限公司。

1.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將載體pET21a 經(jīng)SalⅠ限制性內(nèi)切酶線性化后，用One Step Cloning 試劑盒與ompC基因片段進行重組，于50 ℃孵育15 min，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，于42 ℃孵育1 min；挑選陽性菌株，送深圳華大基因股份有限公司測序。取鑒定正確菌株，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取含ompC基因的質(zhì)粒，將其及esxA基因均經(jīng)SalⅠ和HindⅢ雙酶切后，回收載體片段及目的基因片段，以T4 DNA 連接酶于室溫連接30 min；轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，于42 ℃孵育1 min；挑選陽性菌株，送深圳華大基因股份有限公司測序。取鑒定正確的菌株，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取含ompC?esxA基因的重組表達質(zhì)粒。將空載體pET21a、含ompC基因的表達質(zhì)粒和含ompC?esxA基因的重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21（DE3），即為陰性對照菌、重組蛋白OmpC 重組菌和融合蛋白OmpC?EsxA重組菌，于42 ℃孵育1 min。

1.4 融合蛋白的表達 將3 個菌株于37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；按1∶100 的比例轉(zhuǎn)接至LB 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；加入 IPTG 至終濃度為1 mmol／L，于30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h；11 973 ×g離心5 min，取沉淀，進行12%SDS?PAGE分析。

1.5 OMV的分離 將陰性對照菌和融合蛋白OmpC?EsxA 重組菌按1∶100 的比例分別轉(zhuǎn)接至LB 培養(yǎng)基，于37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；加入IPTG 至終濃度1 mmol／L，于30 ℃誘導(dǎo)表達16 h；于4 ℃，10 775 ×g離心20 min；收集上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，于4 ℃，50 000×g離心2 h；取沉淀，用PBS重懸，經(jīng)100 kDa截留的超濾管濃縮，即獲得OMV，取 5 μL OMV，用1 ×SDS?PAGE 蛋白樣品緩沖液重懸，進行12% SDS?PAGE分析。

1.6 融合蛋白定位至OMV表面的鑒定

1.6.1 Western blot 檢測 分別取陰性對照菌和融合蛋白OmpC?EsxA重組菌及1.5項提取的OMV各5 μL，用1 × SDS?PAGE 蛋白樣品緩沖液重懸，經(jīng)12%SDS?PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入小鼠抗His?Tag 單克隆抗體（1∶5 000稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次，加入HRP 標記的羊抗鼠IgG（1∶10 000 稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，ECL顯色。

1.6.2 納米流式檢測 將陰性對照菌OMV 和融合蛋白OmpC?EsxA重組菌OMV與小鼠抗His?Tag單克隆抗體按1∶100比例混合，于室溫孵育30 min；50 000×g離心2 h，去除多余抗體，標記Alexa Fluor 488偶聯(lián)抗體；標記的樣品用PBS 進行1∶1 000 稀釋，用福流納米流式儀檢測OMV表面融合蛋白的熒光強度。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達質(zhì)粒的鑒定 含ompC基因的重組質(zhì)粒及含ompC?esxA基因的重組表達質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定，與目標序列完全一致，見圖1（含ompC基因的重組質(zhì)粒測序圖略）。

圖1 含ompC?esxA基因的重組表達質(zhì)粒的測序結(jié)果Fig. 1 Sequencing results of recombinant expression plas?mid containing ompC?esxA gene

2.2 融合蛋白的鑒定 分別于相對分子質(zhì)量約54 000及39 000 處可見融合蛋白OmpC?EsxA 及重組蛋白OmpC 目的條帶（目的蛋白條帶上方可見1 條相對分子質(zhì)量約43 000 的非目的條帶，推測可能為重組蛋白OmpC 的前體蛋白），大小與預(yù)期相符；陰性對照未見該目的蛋白條帶。見圖2。

圖2 融合蛋白的SDS?PAGE分析Fig.2 SDS?PAGE profile of fusion protein

2.3 OMV 的鑒定 融合蛋白OmpC?EsxA 重組菌和陰性對照菌提取的 OMV 經(jīng) 12% SDS?PAGE 分析，均可見多條蛋白條帶，且前者總蛋白量高于后者，見圖3。

圖3 OMV總蛋白的SDS?PAGE分析Fig.3 SDS?PAGE profile of total protein of OMV

2.4 融合蛋白定位至OMV表面的鑒定

2.4.1 Western blot 檢測 融合蛋白OmpC?EsxA 重組菌及其OMV 中的融合蛋白可與小鼠抗His?Tag 抗體發(fā)生特異性結(jié)合，且于相對分子質(zhì)量約54 000 處可見特異性結(jié)合條帶，大小與預(yù)期相符；陰性對照未見該條帶。見圖4。表明融合蛋白OmpC?EsxA 成功定位于OMV。

圖4 OMV中融合蛋白OmpC?EsxA的Western blot檢測Fig.4 Western blotting of fusion protein OmpC?EsxA of OMV

2.4.2 納米流式檢測 融合蛋白OmpC?EsxA 重組菌OMV可被熒光抗體標記（877／17 522個顆粒），陰性對照OMV 未被熒光抗體標記（7／14 619個顆粒），見圖5。表明融合蛋白OmpC?EsxA成功定位至OMV表面。

圖5 OMV表面融合蛋白OmpC?EsxA的納米流式分析Fig.5 Analysis of fusion protein OmpC?EsxA of OMV sur?face by Flow NanoAnalyzer

3 討 論

OMV 具有多種生物學(xué)功能，如在生理條件下，OMV 可促進細菌對營養(yǎng)物質(zhì)的攝?。辉趹?yīng)激條件下，OMV 可促進有毒物質(zhì)包括錯誤折疊的蛋白、重金屬、抗生素等的排出；OMV 還可促進遺傳物質(zhì)（如耐藥基因）在細菌間的水平傳播。另外，對于致病菌，OMV 可介導(dǎo)毒力因子向宿主細胞的傳輸，從而破壞宿主的防御系統(tǒng)，增強對宿主細胞的感染。

近年，OMV 的研究熱點逐漸從產(chǎn)生機制及生物學(xué)功能轉(zhuǎn)移至 OMV 疫苗的研發(fā)［8?9］。許多研究對致病菌產(chǎn)生的OMV 進行了抗感染試驗，包括假單銅綠胞菌、沙門菌、腦膜炎球菌等革蘭陰性菌，均取得較好的抗感染效果［2，10?11］；另外，革蘭陽性菌，如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌等產(chǎn)生的OMV 也具有類似的抗感染效果［12?14］。目前，將 OMV改造為疫苗或藥物呈遞載體的研究也取得了較大進展，如有研究將金黃色葡萄球菌蛋白構(gòu)建為重組脂蛋白后，經(jīng)E.coliOMV包裹形成疫苗，該疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了較好的抗金葡菌感染作用［15］；另有研究以E.coli外膜蛋白作為錨定蛋白將抗原定位至OMV上，常用的外膜蛋白有OmpA、ClyA、OmpW 等，均能有效呈遞抗原［16?19］。

本研究采用E.coli表達系統(tǒng)表達了OmpC 與金黃色葡萄球菌EsxA 抗原的融合蛋白；提取重組菌的OMV，經(jīng)Western blot 檢測和福流納米流式儀檢測表明，重組的融合蛋白可以O(shè)mpC 為載體將其定位至OMV 表面。有研究證明，OmpC 及 OmpA 均是 OMV中的通道蛋白，OmpC 可替代OmpA 用于抗原呈遞［20?21］，本研究結(jié)果也證明了該結(jié)論的可行性。綜上所述，OmpC 作為蛋白平臺將抗原定位至OMV 表面具有可行性，有望用于抗原呈遞疫苗的研發(fā)。