陳思思，金育，張玉芳，何春艷，周正淼，劉野

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118

隨著人們對(duì)免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的深入以及科技的發(fā)展，現(xiàn)有疫苗形式變得多樣化。根據(jù)不同病原體的傳染風(fēng)險(xiǎn)與自身特性的差異，可選擇不同抗原形式作為疫苗免疫原成分，如不使用完整的病毒體，而選擇特定的蛋白區(qū)域、核酸片段等作為免疫原；如乙型肝炎表面抗原重組疫苗和以L1晚期蛋白病毒樣顆粒為抗原的HPV疫苗等［1?3］。與經(jīng)典疫苗相比，重組蛋白亞單位疫苗與核酸疫苗等更加安全且利于大規(guī)模生產(chǎn)，但因其免疫原性較弱，通常需要佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答能力或改變免疫應(yīng)答類型［4?5］。佐劑是一種能夠通過(guò)增強(qiáng)免疫反應(yīng)并改變免疫反應(yīng)的類型來(lái)促進(jìn)抗原特異性免疫應(yīng)答的非特異性免疫增強(qiáng)劑，通常可減少抗原用量及免疫次數(shù)，產(chǎn)生更快速和持久的免疫反應(yīng)，提高疫苗的免疫反應(yīng)強(qiáng)度及有效性。傳統(tǒng)的鋁佐劑引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)較弱，佐劑功能受限，近期已被批準(zhǔn)使用的佐劑如MF59、AS01和AS03等，在我國(guó)均缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)［6?8］。因此，迫切需要研發(fā)出新型、強(qiáng)效并有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的佐劑應(yīng)用于疫苗研究。而一種獲批的藥物或生物制劑如佐劑等，往往需要數(shù)年甚至數(shù)十年研發(fā)歷程。為節(jié)省研發(fā)周期，研究者們通常會(huì)選擇一些已獲批的分子作為母體，進(jìn)行修飾改造以改善耐藥性或開拓其他功效［9?11］。

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS?CoV?2）引起的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID?19）在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，嚴(yán)重威脅人類公共健康安全［12?13］。新冠疫苗的研發(fā)是近兩年來(lái)的熱點(diǎn)，SARS?CoV?2的刺突蛋白受體結(jié)合域（receptor?binding do?main，RBD）與人體中的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（an?giotensin?converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合，并介導(dǎo)病毒附著侵入感染［14?15］。宿主感染SARS?CoV?2后，RBD蛋白在誘導(dǎo)中和抗體和T細(xì)胞應(yīng)答以及保護(hù)性免疫中起關(guān)鍵作用，為阻止SARS?CoV?2入侵，研究人員將RBD蛋白作為疫苗研發(fā)的抗原［16?17］。

金剛烷胺是已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用作抗病毒和抗帕金森病的藥物，具有良好的生物安全性［18?19］。本研究選擇金剛烷胺作為母體分子，通過(guò)化學(xué)連接形成金剛烷胺二聚體化合物，并探討金剛烷胺二聚體在新冠RBD蛋白疫苗中能否作為新型佐劑來(lái)增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答強(qiáng)度。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器2?（7?氮雜苯并三氮唑）?N，N，N'，N'?四甲基脲六氟磷酸酯［2?（7?azabenzotriazol?1?yl）?N，N，N'，N'?tetramethyluronium hexafluorophosphate，HATU］、N，N?二異丙基乙胺（N，N?diisopropylethyla?mine，DIPEA）、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、乙醇（EtOH）和N，N?二甲基甲酰胺（N，N?dimethylforma?mide，DMF）購(gòu)自阿達(dá)瑪斯試劑（上海）有限公司；1，4（1，4）?dibenzenacyclohexaphane?12，43?diol購(gòu)自大賽璐藥物手性技術(shù)（上海）有限公司；碳酸銫（Cs2CO3）購(gòu)自TCI（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；金剛烷胺、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氯乙酸甲酯購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司；氫氧化鋁佐劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；SARS?CoV?2的RBD蛋白購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)CLARIO star公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自德國(guó)Heidolph公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB／c小鼠，雌性，6~8周齡，體質(zhì)量約22 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK（滇）K2018?0007。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理審查編號(hào)為：DWSP202?108010。

1.3 金剛烷胺二聚體的合成 合成路線見圖1。樣品鑒定由云南大學(xué)現(xiàn)代儀器分析測(cè)試中心完成。

圖1 金剛烷胺二聚體的合成路線Fig.1 Synthetic route of amantadine dimer

第一步，取代反應(yīng)過(guò)程：稱量20 mg底物S1［即1，4（1，4）?dibenzenacyclohexaphane?12，43?diol］，加至裝有磁力攪拌子的圓底燒瓶中，用3 mL無(wú)水DMF溶解后，加入氯乙酸甲酯（80 μL，0.91 mmol）和Cs2CO3（137 mg，0.42 mmol），油浴60℃下攪拌反應(yīng)20 h；過(guò)濾反應(yīng)物，除去Cs2CO3，用水／乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯相產(chǎn)物；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，得到的產(chǎn)物利用電噴霧電離質(zhì)譜（electrosprayionization?MS，ESI?MS）正離子模式進(jìn)行化合物鑒定。

第二步，水解酸化反應(yīng)過(guò)程：將上一步獲得的化合物作為第二步反應(yīng)的底物S2，用乙醇重新溶解，并加入166.2 mg NaOH，1~2 h 后終止反應(yīng)；用水／乙酸乙酯萃取，保留水相產(chǎn)物；加入HCl 調(diào)pH 為5，再次用水／乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯相產(chǎn)物；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，得到的產(chǎn)物利用ESI?MS 負(fù)離子模式進(jìn)行化合物鑒定。

第三步，酰胺縮合反應(yīng)過(guò)程：將上一步獲得的化合物作為第三步反應(yīng)的底物S3，將30 mg S3 溶解于2 mL 無(wú)水 DMF 中，攪拌下加入金剛烷胺（50 mg，0.327 mmol）、HATU（19.21 mg，0.051 mmol）和 DIPEA（17.6 μL，0.101 mmol），反應(yīng)18~24 h；用水／乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯相產(chǎn)物；用Na2SO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮；經(jīng)薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）進(jìn)行純化，并利用ESI?MS正離子模式進(jìn)行終產(chǎn)物鑒定。

1.4 動(dòng)物免疫 將BALB／c小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只：①R6A+RBD 組：取21 μg（0.033 μmol）R6A與10 μg RBD混合，終體積為100 μL?，F(xiàn)用現(xiàn)配；②Ada+RBD組：取10 μg（0.066 μmol）金剛烷胺與10 μg RBD混合，終體積為100 μL，現(xiàn)用現(xiàn)配；③Alu+RBD 組：取 35 μg 氫氧化鋁佐劑與 10 μg RBD 混合，終體積為100 μL，用前2 h配制；④RBD 組：10 μg RBD，體積為100 μL；⑤Blank 組：0.9%生理鹽水，體積為100 μL，作為陰性對(duì)照。分別在第0、14 和28 天肌肉注射免疫小鼠。于第2次免疫后7 d和末次免疫后14 d，經(jīng)尾靜脈采血，分離血清。

1.5 小鼠血清特異性IgG抗體水平檢測(cè) 采用ELISA法。用 RBD 蛋白（5 μg／mL）包被 96 孔板，50 ~100 μL／孔，置4 ℃包被過(guò)夜；控干板內(nèi)液體，PBST（0.01 mol／L PBS + 0.05% Tween）洗板4 ~ 5 次，拍干板底水分，加入含1% BSA 的PBS，37 ℃封閉2 h；控干板內(nèi)液體，PBST洗板4~5次，拍干板底水分，加入倍比稀釋（1∶10 000 ~ 1∶160 000）的待測(cè)血清，37 ℃孵育 2 h；控干板內(nèi)液體，PBST 洗板4~5 次，拍干板底水分，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋），37 ℃孵育1 h；控干板內(nèi)液體，PBST 洗板4 ~5 次，拍干板底水分，加入 3，3'，5，5'?四甲基聯(lián)苯胺（TMB）與過(guò)氧化氫（H2O2）混合液作為顯色底物，100 μL／孔，37 ℃孵育 8 ~ 10 min；加入 1 mol／L H2SO4，100 μL／孔，終止顯色。于酶標(biāo)儀450和630 nm波長(zhǎng)處，檢測(cè)各孔A值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism軟件（GraphPad，San Diego，CA，USA），組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金剛烷胺二聚體合成中取代反應(yīng)連接結(jié)果 完成第一步取代反應(yīng)后，得到的產(chǎn)物化學(xué)名稱為dimethyl 2，2'?［1，4（1，4）?dibenzenacyclohexaphane?12，43?diylbis（oxy）］diacetate，化學(xué)式為C22H24O6，精準(zhǔn)分子量（Exact Mass）為384.16，命名為1Y。采用正離子模式進(jìn)行ESI?MS檢測(cè)，掃描范圍為80~680 m／z。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果［M+H］+為 385.1651 和［M+Na］+為407.146 8，說(shuō)明反應(yīng)獲得了目標(biāo)產(chǎn)物。見圖2。

圖2 取代反應(yīng)產(chǎn)物1Y質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of product 1Y of substitution reaction

2.2 金剛烷胺二聚體合成中水解酸化反應(yīng)連接結(jié)果完成第二步水解酸化反應(yīng)后，得到的產(chǎn)物化學(xué)名稱為 2，2'?［1，4（1，4）?dibenzenacyclohexaphane?12，43?diylbis（oxy）］diacetic acid，化學(xué)式為C20H20O6，Exact Mass為356.13，命名為20?Cl。采用負(fù)離子模式進(jìn)行ESI?MS檢測(cè)，掃描范圍為125~775 m／z。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果［M?H］-為355.118 6，說(shuō)明反應(yīng)獲得了目標(biāo)產(chǎn)物。見圖3。

圖3 水解酸化反應(yīng)產(chǎn)物20?Cl質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of product（20 ?Cl）of hydrolysis and acidification reaction

2.3 金剛烷胺二聚體合成中酰胺縮合反應(yīng)連接結(jié)果完成第三步酰胺縮合反應(yīng)后，得到的產(chǎn)物化學(xué)名稱為 2，2'?［1，4（1，4）?dibenzenacyclohexaphane?12，43?diylbis（oxy）］bis{N?［（3s，5s，7s）?adamantan?1?yl］acetamide}，化學(xué)式為C40H50N2O4，Exact Mass為622.38，命名為R6A（即金剛烷胺二聚體終產(chǎn)物）。采用正離子模式進(jìn)行ESI?MS檢測(cè)，掃描范圍為200~1 300 m／z。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果［M+H］+為623.384 6 和［2M+Na］+為1 267.744 0，說(shuō)明反應(yīng)獲得了目標(biāo)產(chǎn)物。見圖4。

圖4 水解酸化反應(yīng)產(chǎn)物R6A質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of product R6A of hydrolysis and acidification reaction

2.4 小鼠血清特異性IgG抗體水平

2.4.1 2次免疫后小鼠血清抗體水平 結(jié)果顯示，R6A+RBD 組各稀釋度小鼠血清抗體水平均高于Ada +RBD組，但均低于Alu+RBD組。血清稀釋度1∶10 000時(shí)，R6A+RBD 組與 Ada+RBD 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.21，P<0.05）；血清稀釋度為1∶80 000和 1∶160 000 時(shí)，R6A + RBD 組與 Alu + RBD 組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為15.19 和17.71，P均<0.05）。見圖5。表明R6A可作為新型佐劑增強(qiáng)新冠蛋白疫苗的免疫應(yīng)答潛力。

圖5 2次免疫后小鼠血清抗體水平Fig.5 Serum antibody level of mice after two doses of immu?nization

2.4.2 3 次免疫后小鼠血清抗體水平 結(jié)果顯示，3次免疫后R6A+RBD 組各稀釋度小鼠血清抗體水平均高于Ada+RBD 和Alu+RBD 組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F均 >30，P均<0.000 1和 <0.01），見圖6。表明R6A的佐劑效用呈劑量依賴性。

圖6 3次免疫后小鼠血清抗體水平Fig.6 Serum antibody level of mice after three doses of imm?unization

3 討論

截至目前，已有70 多種疫苗被批準(zhǔn)用于預(yù)防約30種病原體。盡管如此，要研發(fā)更安全、更有效且低成本的疫苗仍然面臨挑戰(zhàn)［6，20?21］。隨著生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，可選擇更安全的亞單位如蛋白質(zhì)、多肽等作為疫苗抗原，但這類疫苗往往免疫原性較弱，需要有效的佐劑來(lái)增強(qiáng)其免疫反應(yīng)［5，22?23］。

基于前期對(duì)金剛烷胺的研究基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)對(duì)金剛烷胺進(jìn)行修飾后，能增強(qiáng)其佐劑效應(yīng)［24?25］。因此，本研究選擇以金剛烷胺作為母體分子，合成金剛烷胺二聚體，并探討新型金剛烷胺二聚體佐劑對(duì)新冠蛋白疫苗誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果表明，2次免疫后，金剛烷胺二聚體誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答水平高于金剛烷胺單體，但低于鋁佐劑；而3次免疫后，金剛烷胺二聚體誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答水平均高于金剛烷胺單體和鋁佐劑。表明金剛烷胺二聚體佐劑能夠提高新冠蛋白疫苗誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的能力，具有良好的佐劑效應(yīng)，可作為備選佐劑，這種基于現(xiàn)有藥物改造的策略為開發(fā)新型佐劑提供了新思路。

綜上所述，金剛烷胺二聚體可作為一種新型候選佐劑，對(duì)體液免疫應(yīng)答的提高具有明顯的劑量依賴性，體現(xiàn)了加強(qiáng)免疫的重要性，但這種依賴性增強(qiáng)的機(jī)制目前尚不清楚，對(duì)于細(xì)胞免疫的作用也有待進(jìn)一步研究。除此之外，本研究?jī)H探討了該佐劑在新冠蛋白疫苗中的作用，有望應(yīng)用于其他多種病原體、多種形式的疫苗，以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。