滿在偉，崔慧慧，蔣心怡，鄒平，張迎陽，郭靜

（1.常州大學(xué)石油化工學(xué)院食品學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.山東恒仁工貿(mào)有限公司，山東 棗莊 277533；3.常州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 常州 213164）

葡萄糖酸廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、建筑等行業(yè)中[1-3]。目前，葡萄糖酸主要采用生物法催化葡萄糖氧化生產(chǎn)，包括酶催化和微生物發(fā)酵2種方式。酶催化法是利用葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶共同作用將葡萄糖氧化成葡萄糖酸，該法存在用酶成本高的問題。微生物發(fā)酵法是培養(yǎng)具有較強(qiáng)葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶合成能力的菌株，使葡萄糖氧化生產(chǎn)葡萄糖酸[4-8]。因此，產(chǎn)酶能力強(qiáng)和培養(yǎng)要求低的微生物菌株是發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸的關(guān)鍵。目前，發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸最有競爭力的微生物是黑曲霉[6-8]，而葡萄糖酸的生產(chǎn)研究也大多與黑曲霉相關(guān)。氧氣供應(yīng)是葡萄糖酸生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，通過優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸鈉過程中的氧氣供應(yīng)方式，采用兩階段供氧策略可提高葡萄糖酸鈉得率[2]。通過調(diào)整發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速將黑曲霉菌體形態(tài)控制為分散狀，可提高氧氣傳遞速率和葡萄糖酸生產(chǎn)效率，50 L發(fā)酵罐中葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到21.0 g/（L·h），葡萄糖酸得率為1.05 g/g[3]。研究表明，黑曲霉催化葡萄糖合成葡萄糖酸的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶分布并固定在菌絲體細(xì)胞壁的外圍[3，7-8]。已有研究循環(huán)使用黑曲霉細(xì)胞使其用于連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸工藝，可降低用于細(xì)胞生長及維持所需碳源，能夠明顯提高葡萄糖酸生產(chǎn)速率及得率[8]。也有研究將產(chǎn)葡萄糖酸黑曲霉菌體進(jìn)行回收，然后將細(xì)胞破碎提取葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，并重復(fù)用于酶促反應(yīng)生產(chǎn)葡萄糖酸[6]。

低聚異麥芽糖是一類含有一個(gè)或多個(gè)α-1，6糖苷鍵的低聚葡萄糖。低聚異麥芽糖由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，不能被口腔菌群利用，因此具有抗齲齒功能，其具有良好的雙歧桿菌增殖功能，能夠促進(jìn)腸道菌群平衡健康[9-11]。目前，低聚異麥芽糖主要采用酶法催化生產(chǎn)，首先將淀粉通過酶法水解成麥芽糖，然后利用α-葡萄糖苷酶催化麥芽糖生成低聚異麥芽糖[12-14]。α-葡萄糖苷酶的催化產(chǎn)物是異麥芽糖（isomaltose，IG2）、潘糖（panose，P）、異麥芽三糖（isomaltotriose，IG3）、異麥芽四糖和異麥芽五糖等混合物，其中IG2、P和IG3是體現(xiàn)低聚異麥芽糖功能性的主要成分，也是衡量低聚異麥芽糖質(zhì)量的重要指標(biāo)，又稱有效三糖。另外，α-葡萄糖苷酶催化過程中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物葡萄糖并殘留少量麥芽糖[15-16]。根據(jù)GB/T 20881—2017《低聚異麥芽糖》規(guī)定，低聚異麥芽糖產(chǎn)品分為50型（isomaltooligosaccharide-50，IMO-50）和 90 型（isomaltooligosaccharide-90，IMO-90）兩種糖漿（粉），90型產(chǎn)品總低聚異麥芽糖含量不低于90%（占干物質(zhì)），其中有效三糖含量不低于45%（占干物質(zhì)）[17-18]。為了得到IMO-90型低聚異麥芽糖產(chǎn)品，需要將α-葡萄糖苷酶催化產(chǎn)物中的葡萄糖和麥芽糖含量降低。例如，可以采用酵母菌發(fā)酵法將葡萄糖和麥芽糖吸收并代謝生成酒精以提高低聚異麥芽糖純度[15-16]；也可利用乳酸菌發(fā)酵法提高低聚異麥芽糖純度，但是乳酸菌會(huì)消耗一部分低聚異麥芽糖，降低產(chǎn)品收率[19]。此外，將IMO-50型產(chǎn)品中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸也可提高低聚異麥芽糖純度。徐小艷等[20]利用葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，可將商品化低聚異麥芽糖中的葡萄糖完全氧化去除，低聚異麥芽糖純度可由62.78%提高至85.28%。姜艷軍等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，將葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶固定化后可重復(fù)用于氧化去除低聚異麥芽糖產(chǎn)品中的葡萄糖，葡萄糖去除率可達(dá)80%。但是，利用葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶純化低聚異麥芽糖存在用酶成本較高和麥芽糖不能去除的問題。

本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選到的產(chǎn)葡萄糖酸黑曲霉AnM1進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，并對(duì)菌體重復(fù)利用產(chǎn)葡萄糖酸進(jìn)行探究，以提高葡萄糖酸生產(chǎn)效率；隨后對(duì)利用黑曲霉AnM1菌體純化低聚異麥芽糖進(jìn)行研究，以期為產(chǎn)葡萄糖酸黑曲霉菌體重復(fù)利用以及低聚異麥芽糖和葡萄糖酸聯(lián)產(chǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）AnM1：常州大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室篩選并斜面低溫（4℃）保藏。

1.1.2 主要試劑

α-葡萄糖苷酶（500 000 U/mL）：江蘇銳陽生物科技有限公司；葡糖淀粉酶（260 000 U/mL）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；CuCl2（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米漿（試劑級(jí)）：上海阿拉丁生化科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、5 g/L玉米漿、0.3 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、5 g/L 輕質(zhì)碳酸鈣、20 g/L瓊脂粉。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：120 g/L葡萄糖、1 g/L玉米漿、0.3 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、40 g/L 輕質(zhì)碳酸鈣、0.3 g/L消泡劑。

優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基：120 g/L葡萄糖、0.8 g/L玉米漿、0.3 g/L KH2PO4、0.3 g/L MgSO4·7H2O、40 g/L 輕質(zhì)碳酸鈣、0.3 g/L消泡劑。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（StabS2型）：上海潤度生物科技有限公司；離心機(jī)（1-14型）：德國Sigma公司；生物傳感分析儀（S-10）：深圳市西爾曼科技有限公司；高溫干燥箱（DHG-9038A）：無錫瑪瑞特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉AnM1孢子培養(yǎng)及葡萄糖酸發(fā)酵

將黑曲霉AnM1凍管孢子懸液劃線至斜面培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)7 d。待菌落表面布滿孢子，用5 mL無菌水沖洗培養(yǎng)好的黑曲霉斜面，獲得孢子懸液。取1 mL孢子懸液接入裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL帶擋板三角瓶中，37℃、220 r/min發(fā)酵，待葡萄糖濃度降至2 g/L以下時(shí)結(jié)束發(fā)酵。葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度、葡萄糖酸得率的計(jì)算公式如下。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)，分別改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L）、KH2PO4（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）和 MgSO4·7H2O（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）的濃度，37℃、220 r/min發(fā)酵，待葡萄糖濃度降至2 g/L以下時(shí)結(jié)束發(fā)酵，考察培養(yǎng)基組分對(duì)黑曲霉AnM1發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸的影響。

1.3.3 黑曲霉AnM1菌體重復(fù)利用產(chǎn)葡萄糖酸

利用優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行黑曲霉AnM1發(fā)酵，產(chǎn)葡萄糖酸，發(fā)酵結(jié)束后，開放條件下30 mL發(fā)酵液離心（8 000×g，5 min，25℃）收集黑曲霉菌體。利用30 mL轉(zhuǎn)化液（120 g/L葡萄糖、40 g/L輕質(zhì)碳酸鈣、0.3 g/L消泡劑）懸浮黑曲霉菌體，然后裝入500 mL帶擋板三角瓶。37℃、220 r/min發(fā)酵，待葡萄糖濃度降至2 g/L以下時(shí)結(jié)束發(fā)酵。然后，取30 mL發(fā)酵液再次離心（8 000×g，5 min，25℃）收集黑曲霉菌體，并在相同條件下重復(fù)利用產(chǎn)葡萄糖酸。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶催化麥芽糖生成低聚異麥芽糖

去離子水溶解麥芽糖，利用1 mol/L HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值，配制成麥芽糖濃度為300 g/L、pH4.5的麥芽糖溶液。添加450 μL/L α-葡萄糖苷酶，混勻后將反應(yīng)液置于54℃環(huán)境中，靜置反應(yīng)24 h。

1.3.5 低聚異麥芽糖反應(yīng)液中葡萄糖與麥芽糖的去除

低聚異麥芽糖反應(yīng)液中的葡萄糖可直接利用黑曲霉AnM1菌體氧化去除。黑曲霉AnM1菌體的收集同1.3.3的方法。取1.3.4中的低聚異麥芽糖反應(yīng)液30 mL，再添加30 mL黑曲霉AnM1發(fā)酵液收集的菌體、40 g/L輕質(zhì)碳酸鈣、0.3 g/L消泡劑，37℃、220 r/min反應(yīng)，待葡萄糖濃度降至2 g/L以下時(shí)結(jié)束反應(yīng)。低聚異麥芽糖反應(yīng)液添加0.02%葡糖淀粉酶，54℃靜置反應(yīng)2 h，然后90℃滅酶10 min，將剩余麥芽糖水解成葡萄糖。待反應(yīng)液溫度降至37℃，利用黑曲霉AnM1菌體氧化去除葡萄糖。

1.3.6 分析方法

菌體量通過稱量細(xì)胞干重進(jìn)行測定，取20 mL發(fā)酵液離心收集菌體，菌體利用去離子水清洗3次，然后置于105℃烘干并進(jìn)行稱重。葡萄糖含量利用生物傳感分析儀進(jìn)行測定。葡萄糖酸采用二價(jià)銅離子顯色法測定[1]，為避免發(fā)酵液中Ca2+與SO42-形成沉淀而影響測量，因此本文利用CuCl2代替CuSO4。同時(shí)，選取特定葡萄糖酸發(fā)酵樣品寄送至南京仁研測試公司進(jìn)行高效液相色譜分析。葡萄糖酸高效液相色譜檢測條件：色譜柱為Amethyst C18-H液相色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇和磷酸水溶液（50 mL甲醇和5 mL磷酸用去離子水稀釋至1 L），柱溫25℃，流動(dòng)相流速1 mL/min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量10 μL。對(duì)低聚異麥芽糖反應(yīng)液中麥芽糖、低聚異麥芽糖等糖的含量測定采用液相色譜分析方法，樣品送至江南大學(xué)分析測試中心進(jìn)行分析，液相色譜檢測條件參照GB/T 20881—2017《低聚異麥芽糖》[17]中的方法進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉AnM1葡萄糖酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

葡萄糖氧化成葡萄糖酸需要消耗氧氣，因此葡萄糖酸發(fā)酵是一個(gè)極度耗氧的過程，需要大量氧氣供給[2-3]。本文利用帶擋板三角瓶、較少的裝液量（30 mL）和較高的搖床轉(zhuǎn)速（220 r/min）進(jìn)行黑曲霉AnM1葡萄糖酸發(fā)酵以保證供氧量。培養(yǎng)基成分對(duì)黑曲霉AnM1發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸的影響如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)基成分對(duì)黑曲霉AnM1發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸的影響Fig.1 The effects of components in medium on gluconic acid fermentation production by Aspergillus niger AnM1

由圖1A可知，培養(yǎng)基中玉米漿添加量對(duì)黑曲霉AnM1菌體生長和葡萄糖酸合成具有重要影響。玉米漿含有菌體生長所需的多種物質(zhì)，隨著培養(yǎng)基中玉米漿添加量的增加，菌體量逐漸增加。在玉米漿添加量為0.2 g/L～0.8 g/L時(shí)，黑曲霉AnM1葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度由3.3 g/（L·h）提高至5.1 g/（L·h）。當(dāng)玉米漿添加量繼續(xù)增加時(shí)，葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度不再提高，這種現(xiàn)象可能由菌體所含的葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶總量和供氧量限制所導(dǎo)致[7-8]。當(dāng)玉米漿添加量在0.8 g/L以下時(shí)，菌體生長量較少導(dǎo)致發(fā)酵體系中葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶總量較少，酶總量是葡萄糖酸合成的限制性因素。當(dāng)玉米漿添加量在0.8 g/L以上時(shí)，菌體量較大，菌體所含的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶總量不再是限制性因素，供氧量成為葡萄糖酸合成的限制性因素，因此葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度不會(huì)繼續(xù)隨著菌體量的增加而增加。葡萄糖酸得率隨著菌體量的增加逐漸下降，由0.97 g/g葡萄糖降至0.91 g/g葡萄糖，這可能是由于菌體生長和維持需要消耗一部分葡萄糖[7]。綜合考慮葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度和得率，玉米漿添加量選擇0.8 g/L。

由圖1B可知，培養(yǎng)基中KH2PO4添加量同樣對(duì)黑曲霉AnM1菌體生長和葡萄糖酸合成具有重要影響。磷源是菌體生長所必需的物質(zhì)，隨著KH2PO4添加量的增加，黑曲霉AnM1菌體量和葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度逐漸增加而后趨于平穩(wěn)。造成這種現(xiàn)象的原因是當(dāng)KH2PO4添加量高于0.3g/L時(shí)，玉米漿添加量是菌體生長的限制性因素，培養(yǎng)基中由于玉米漿提供的氮源、金屬離子等不足限制了菌體的生長。結(jié)合玉米漿添加量優(yōu)化試驗(yàn)，當(dāng)玉米漿添加量為0.8 g/L、KH2PO4添加量為0.3 g/L時(shí)，菌體所含葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的總量不再是葡萄糖酸合成的限制性因素，由于供氧量限制，繼續(xù)增加菌體量，葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度并不會(huì)繼續(xù)增加。因此，KH2PO4添加量選擇0.3 g/L。

由圖1C可知，培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O添加量對(duì)黑曲霉AnM1菌體生長和葡萄糖酸合成影響不顯著（p＞0.05），當(dāng) MgSO4·7H2O 添加量為 0.3 g/L 時(shí)，葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度[5.3 g/（L·h）]和得率（0.94 g/g葡萄糖）均較高，因此MgSO4·7H2O添加量選擇0.3 g/L。

結(jié)合葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度和得率確定了黑曲霉AnM1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分。黑曲霉AnM1搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸的生產(chǎn)強(qiáng)度和得率已達(dá)到其他已報(bào)道的高產(chǎn)葡萄糖酸黑曲霉菌株生產(chǎn)水平[5，22]。但是，黑曲霉AnM1搖瓶發(fā)酵過程中的葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度遠(yuǎn)低于發(fā)酵罐中黑曲霉發(fā)酵過程[2-3，7-8]，這是由于發(fā)酵罐的供氧水平明顯高于搖瓶發(fā)酵過程，高水平的供氧能夠明顯提高葡萄糖酸的生產(chǎn)[7-8]。

2.2 黑曲霉AnM1菌體重復(fù)利用產(chǎn)葡萄糖酸

對(duì)黑曲霉AnM1菌體重復(fù)利用產(chǎn)葡萄糖酸進(jìn)行研究，菌體收集和重復(fù)利用產(chǎn)葡萄糖酸在開放條件下進(jìn)行，為避免雜菌污染，發(fā)酵液（轉(zhuǎn)化液）中不添加氮源，僅含有葡萄糖、碳酸鈣和消泡劑。圖2為重復(fù)利用次數(shù)對(duì)黑曲霉AnM1菌體產(chǎn)葡萄糖酸的影響。

圖2 重復(fù)利用黑曲霉AnM1菌體產(chǎn)葡萄糖酸Fig.2 Gluconic acid production by recycling the A.niger AnM1 mycelia

由圖2可知，黑曲霉AnM1菌體重復(fù)利用也可高效生產(chǎn)葡萄糖酸。與直接發(fā)酵過程（圖1C）相比，葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度有明顯提高，菌體重復(fù)利用前3次，葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度均在7 g/（L·h）以上。這是由于菌體重復(fù)利用過程沒有菌體生長與產(chǎn)酶階段，菌體所含的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶直接催化葡萄糖合成葡萄糖酸，可以縮短發(fā)酵時(shí)間，因此與直接發(fā)酵過程相比生產(chǎn)強(qiáng)度明顯提高。隨著菌體重復(fù)利用次數(shù)的增加，葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度逐漸下降，推測是由于長時(shí)間重復(fù)使用導(dǎo)致菌體破碎，部分葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶脫離菌體釋放到轉(zhuǎn)化液中，離心回收菌體并不能將轉(zhuǎn)化液上清液中的酶重新回收；同時(shí)，菌體長時(shí)間重復(fù)使用過程中葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶酶活降低。菌體重復(fù)利用第5次，生產(chǎn)強(qiáng)度降至5.6 g/（L·h），與直接發(fā)酵[5.3 g/（L·h）]相近。與直接發(fā)酵過程（圖1C）相比，黑曲霉AnM1菌體重復(fù)利用時(shí)葡萄糖酸得率也有所提高，達(dá)到1.02 g/g葡萄糖左右，這是由于菌體的重復(fù)利用幾乎沒有菌體生長，更多的葡萄糖用于葡萄糖酸合成。

2.3 黑曲霉AnM1純化低聚異麥芽糖

利用黑曲霉AnM1菌體氧化低聚異麥芽糖反應(yīng)液中的葡萄糖來提高低聚異麥芽糖純度，結(jié)果如表1所示。

表1 低聚異麥芽糖溶液的糖組成成分Table 1 Composition of saccharides in isomaltooligosaccharides solution

由表1可知，α-葡萄糖苷酶催化麥芽糖溶液得到的低聚異麥芽糖反應(yīng)液中總低聚異麥芽糖含量占總糖的54.9%，其中有效三糖含量占總糖的37.8%，符合GB/T 20881—2017《低聚異麥芽糖》中IMO-50型產(chǎn)品要求[17]。

低聚異麥芽糖反應(yīng)液中葡萄糖含量達(dá)到122.6 g/L，占總糖含量的39.9%。黑曲霉直接純化后的低聚異麥芽糖溶液中總低聚異麥芽糖含量占總糖的91.6%，其中有效三糖含量占總糖的61.7%，符合GB/T 20881—2017《低聚異麥芽糖》中IMO-90型產(chǎn)品要求[17]。因此，利用黑曲霉AnM1菌體將低聚異麥芽糖反應(yīng)液中的葡萄糖氧化成葡萄糖酸，可以明顯提高溶液中低聚異麥芽糖占總糖的比例，提高低聚異麥芽糖純度。由表1還可以看出，黑曲霉AnM1菌體基本不會(huì)降解低聚異麥芽糖，不會(huì)降低低聚異麥芽糖收率。黑曲霉直接純化過程沒有使α-葡萄糖苷酶失活，α-葡萄糖苷酶可以繼續(xù)發(fā)揮作用，因此異麥芽三糖、潘糖和四糖及其以上低聚糖的含量略有上升。

黑曲霉直接純化后，溶液中麥芽糖是影響低聚異麥芽糖純度的主要成分。因此，在黑曲霉純化前，利用葡糖淀粉酶將麥芽糖水解成葡萄糖，然后利用黑曲霉氧化葡萄糖。因?yàn)槠咸堑矸勖妇哂芯徛猞?1，6糖苷鍵的能力[23]，為減少葡糖淀粉酶對(duì)低聚異麥芽糖的降解，在葡糖淀粉酶短時(shí)間作用后進(jìn)行高溫滅酶操作。由表1可以看出，添加葡糖淀粉酶后黑曲霉純化溶液中低聚異麥芽糖含量有所降低，但總低聚異麥芽糖含量占總糖的比例提高至97.1%，其中有效三糖含量占總糖比例提高至66.9%。

利用黑曲霉AnM1純化低聚異麥芽糖反應(yīng)液后，離心收集菌體并重復(fù)用于直接純化低聚異麥芽糖反應(yīng)液，反應(yīng)過程葡萄糖酸合成的分析結(jié)果見圖3。

圖3 重復(fù)利用黑曲霉AnM1菌體純化低聚異麥芽糖Fig.3 Purification of isomaltooligosaccharides by recycling the A.niger AnM1 mycelia

由圖3可知，黑曲霉AnM1菌體重復(fù)3次用于直接純化低聚異麥芽糖反應(yīng)液過程中，葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度沒有明顯降低，重復(fù)利用5次的葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度也在5 g/（L·h）以上，表明黑曲霉AnM1菌體可以重復(fù)應(yīng)用于純化低聚異麥芽糖。同時(shí)，黑曲霉AnM1菌體用于純化低聚異麥芽糖反應(yīng)液過程中，葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度相比菌體重復(fù)利用產(chǎn)葡萄糖酸過程（圖2）有所降低，這種現(xiàn)象是供氧量降低導(dǎo)致的。純化低聚異麥芽糖過程反應(yīng)液中總糖含量約為300 g/L，而菌體重復(fù)利用產(chǎn)葡萄糖酸過程葡萄糖濃度約為120 g/L，較高的糖濃度會(huì)影響氧傳遞，而供氧量下降導(dǎo)致了葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度下降。

3 結(jié)論

本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的黑曲霉AnM1發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸進(jìn)行了研究，結(jié)合葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度和得率確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，優(yōu)化后葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度為5.3 g/（L·h）、得率為0.94 g/g葡萄糖。黑曲霉AnM1發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸后收集的菌體可重復(fù)利用，用于催化葡萄糖氧化產(chǎn)葡萄糖酸。菌體重復(fù)利用前3次的葡萄糖酸生產(chǎn)強(qiáng)度在7 g/（L·h）以上，菌體重復(fù)利用5次生產(chǎn)強(qiáng)度降至5.6 g/（L·h）。與直接發(fā)酵過程相比，菌體重復(fù)利用過程葡萄糖酸得率也有所提高，達(dá)到1.02 g/g葡萄糖左右。因此，黑曲霉AnM1菌體重復(fù)利用可以提升葡萄糖酸發(fā)酵效率，降低發(fā)酵成本。

利用黑曲霉AnM1菌體氧化低聚異麥芽糖反應(yīng)液中的葡萄糖可提高低聚異麥芽糖純度。黑曲霉直接純化后的低聚異麥芽糖溶液中總低聚異麥芽糖含量占總糖的91.6%，其中有效三糖含量占總糖的61.7%，符合GB/T 20881—2017《低聚異麥芽糖》中的IMO-90型產(chǎn)品要求，而且低聚異麥芽糖收率基本沒有影響。利用葡糖淀粉酶將低聚異麥芽糖反應(yīng)液中殘留的麥芽糖水解成葡萄糖，然后利用黑曲霉純化，總低聚異麥芽糖含量占總糖的比例提高至97.1%，其中有效三糖含量占總糖比例提高至66.9%，因此，黑曲霉AnM1菌體同樣可以重復(fù)應(yīng)用于純化低聚異麥芽糖。利用黑曲霉AnM1可以將低聚異麥芽糖反應(yīng)液中的葡萄糖和麥芽糖轉(zhuǎn)化成容易分離的葡萄糖酸，且低聚異麥芽糖純化效果好，工藝簡單，并且可以得到副產(chǎn)品葡萄糖酸，具有很好的應(yīng)用前景。