陳妍，陳復生，張麗芬，2*，張明珠

（1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.河南省南街村（集團）有限公司，河南 漯河 462600）

淀粉酶作為一種基本的工業(yè)用酶，分為α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶[1]。其中α-淀粉酶是一種應用較為廣泛的工業(yè)用酶，它可以作用于淀粉和其它多糖的內部α-1-4糖苷鍵[2]，從而產生葡萄糖和麥芽糖等多種物質，目前工業(yè)上利用其生產了乙醇、高果糖玉米糖漿、食品、紡織物和洗滌劑等[2]。作為重要的大分子生物催化劑，酶分子具有高效性和特異性，是常用的化學催化劑的良好替代品。此外，酶促反應是在較為溫和的條件下進行，所產生的副產物和污染少。因此，近年來，酶分子在制藥、化工、生物、食品等行業(yè)的應用明顯增加[3]。然而，酶分子在極端條件下具有相對較低的穩(wěn)定性，并且在商業(yè)應用中成本頗高[4]。為了改善這些局限性，提高酶活力、穩(wěn)定性、再利用能力和酶的效率成為了研究的熱點。其中，研究多采用超聲波處理、微波輻射、高靜水壓、超臨界二氧化碳處理以及蛋白質工程修飾酶分子等方法對酶的特性進行改善[5]。例如，通過對酶分子表面的多聚賴氨酸修飾可以有效提高肌氨酸氧化酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性[6]；還有研究者通過改善亞臨界和超臨界處理條件進而增強了α-淀粉酶的酶活力[7]等。由于生物技術在不斷發(fā)展和吸引新方法，基于綠色和科學的原則，超聲波作為綠色、科學以及高效的物理技術受到越來越多的關注。

超聲波是一種音調高于人類聽力范圍的機械振蕩聲波，頻率范圍在20 kHz～10 MHz，根據不同的頻率級別，超聲波可以在不同的領域發(fā)揮重要的用途，例如醫(yī)學、農業(yè)、材料科學、生物以及化學等，為新產品的開發(fā)和可持續(xù)生產提供技術支撐。超聲波作為一種非熱物理技術，還因其具有效率高、儀器要求低、經濟可行性等優(yōu)點，在食品工業(yè)中的應用越來越受到重視。當超聲波通過液體介質時，會產生機械振動、聲流和聲空化。其中，聲空化效應在食品行業(yè)中的應用尤為重要?？栈F象的形成是由于液體中空穴的形成、生長和內爆崩塌，在此過程中會釋放出大量高度局部化的能量，這就使得暴露在超聲場的物質受其影響發(fā)生性質上的改變。目前，超聲波在食品工業(yè)中的應用可分為低強度和高強度。其中，低強度超聲是使用小振幅的超聲波，這不僅會引起物質性質的有利變化，還可以加速某些化學反應和工業(yè)過程[8-9]。研究表明，在超聲場環(huán)境下，酶的催化活性會因連續(xù)產生的空化流和氣泡受到影響，超聲波通過擾動酶的環(huán)和結構域來改變酶的三維結構，從而影響酶活力[10]。較低強度和短時間的超聲波處理有利于提高酶活力，并且超聲波還能在不改變酶結構完整性的情況下，使分子發(fā)生有利的構象變化[11]，例如低強度超聲可以激活β-D-葡萄糖苷酶的活性，使其具有活性位點的α-螺旋結構含量增加，從而使酶活力增強，反之隨著超聲強度的增加則會抑制其活性[12]。以上研究表明，超聲技術可以通過改變酶的構象從而改善其功能并促進酶和底物之間的相互作用，這為酶的修飾提供了新的思路與技術手段。

綜上所述，本研究通過探討超聲處理對α-淀粉酶酶活力的影響，并且利用米氏方程、圓二色譜和熒光光譜分析超聲對α-淀粉酶動力學參數和分子結構的影響，闡明超聲作用下α-淀粉酶酶活力的變化機制，表明超聲處理能夠提高反應速度和催化效率的潛在優(yōu)勢，為超聲在酶促反應中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

可溶性淀粉、無水葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學有限公司；α-淀粉酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要設備

TU-1901型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細胞粉碎機、DC-2006型節(jié)能型智能恒溫槽：寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C型精密pH計：上海大普儀器有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；MOS 450圓二色譜儀：法國比奧羅杰公司；MY17040001熒光分光光度計：安捷倫科技有限公司；GL224-1SCN電子分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

取50 mL、pH6的磷酸鹽緩沖溶液，提前預熱至45℃，加入α-淀粉酶使其充分溶解后搖勻，作為試驗樣品備用。

1.3.2 酶活力測定

參照Souza等[13]的方法并加以修改，繪制葡萄糖標準曲線，用于測定α-淀粉酶酶活力。定義酶活力單位（1 U）為在試驗條件下每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量（mg）。將可溶性淀粉溶液作為α-淀粉酶的水解底物，酶解反應時間固定為15 min，反應結束后，立即加入1 mol/L HCl進行滅酶處理。然后加入3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑，在沸水浴煮沸5 min，取出至冷卻后，加蒸餾水定容至25 mL。立即用紫外可見分光光度計在540 nm處測定吸光度，根據繪制的葡萄糖標準曲線y=0.594 0x-0.018 1（R2=0.997 8），求得酶活力。

1.3.3 單因素試驗

選擇超聲功率密度（1.90、2.85、3.80、4.75、5.70W/cm3）、超聲處理時間（5、15、25、35、45 min）、超聲溫度（25、35、45、55、65℃）進行單因素試驗。以未超聲處理的α-淀粉酶的酶活試驗為對照，探究各因素對α-淀粉酶酶活力的影響。

1.3.4 酶促動力學試驗

以底物濃度分別為 1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、9.6 mg/mL的可溶性淀粉溶液作為反應底物，加入超聲處理與未處理的α-淀粉酶溶液分別進行水解反應。反應結束后，立即加入1 mol/L HCl滅酶，然后加入DNS試劑，在沸水浴中加熱5min，取出冷卻后，用蒸餾水定容至25 mL。用紫外可見分光光度計在540 nm處測定吸光度。采用Lineweaver-Burk方程作雙倒數曲線來判定超聲處理對α-淀粉酶的酶促動力學影響。

Michaelis-Menton方程如下。

Lineweaver-Burk方程如下。

式中：V為初始反應速率，mg/（mL·min）；S為底物濃度，mg/mL；Vmax為最大初始反應速率，mg/（mL·min）；Km為米氏常數，mg/mL。

1.3.5 圓二色譜測定

參照Yu等[14]的方法并加以修改，在室溫（25±1）℃下，利用圓二色譜儀對α-淀粉酶進行光譜掃描。圓二色譜儀以掃描速度為50 nm/min進行掃描，記錄α-淀粉酶從190 nm到250 nm的圓二色譜（circular dichroism，CD）變化。CD 數據以平均殘基橢圓率[θ]表示，單位為（deg·cm2）/dmol，并利用 CD pro軟件計算得出 α-淀粉酶的α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規(guī)則卷曲含量。以不含α-淀粉酶的磷酸鹽緩沖溶液作為空白溶液。

1.3.6 熒光光譜測定

參照Yu等[14]的方法并加以修改，使用熒光分光光度計在室溫（25±1）℃下，在激發(fā)波長278 nm（狹縫=5 nm）、發(fā)射波長300 nm～500 nm（狹縫=5 nm）下測量樣品的熒光發(fā)射光譜。以不含α-淀粉酶的磷酸鹽緩沖溶液作為空白溶液。

1.4 數據處理

數據以平均值±標準差表示。利用SPSS 26.0和Microsoft Excel 2016對試驗數據進行處理分析，并采用ANOVA方差分析進行顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 超聲條件對α-淀粉酶酶活力的影響

超聲對α-淀粉酶酶活力的影響見圖1。

圖1 超聲波對α-淀粉酶的酶活力的影響Fig.1 Effect of ultrasound on α-amylase activity

由圖1（a）可知，超聲處理后，隨著超聲功率密度的增加，α-淀粉酶酶活力整體呈現上升趨勢，在超聲功率密度為2.85 W/cm3時酶活力達到最高，與未經超聲處理的α-淀粉酶酶活力相比提高了14.30%，但當超聲功率密度繼續(xù)增大時，α-淀粉酶酶活力變化差異不顯著（P＞0.05）。與傳統的熱變性不同，低強度的超聲不會對酶的活性位點造成破壞，這與文獻[14]通過探究超聲波對木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的研究結果一致。超聲處理可以通過破壞弱相互作用，如氫鍵或范德華力等，從而引起酶結構的構象變化，而超聲波作用產生的穩(wěn)定空化氣泡振蕩所產生的力可以直接作用于酶分子使得酶聚合體分散，并且也能夠通過改變酶分子結構使得酶分子活性位點暴露，從而提高酶活力[14]。因此，選擇2.85 W/cm3為最佳超聲功率密度。

由圖1（b）可知，α-淀粉酶酶活力在超聲5 min時顯著增加（P＜0.05），之后隨著超聲時間的延長趨于穩(wěn)定。在低頻和中等強度的液體超聲處理時會形成穩(wěn)定的空化效應，而穩(wěn)定的空化氣泡崩塌產生的剪切力會改變酶構象，從而導致更多的活性位點暴露。隨著超聲時間的延長，α-淀粉酶在穩(wěn)定的空化作用下，結構未被破壞，保持了原有的活性[15]。且超聲處理過程中出現的穩(wěn)定空化現象是α-淀粉酶酶活力增強的原因[16]。因此，選擇5 min為最佳超聲時間。

由圖1（c）可知，隨著超聲溫度的升高，α-淀粉酶酶活力呈先上升后明顯下降的趨勢，在溫度為45℃時活力達到最高。這表明超聲波處理可以在低溫下刺激α-淀粉酶的活性，低溫環(huán)境下，超聲波所產生的空化效應更好，并且高溫會削弱酶的活性，這與Souza等[13]的結論一致，Souza等[13]的研究表明，在最佳的超聲溫度下可以更有效地破壞如氫鍵、偶極吸引和范德華力等相互作用，并且空化效應會提高微區(qū)溫度，形成的局部高溫導致蛋白質發(fā)生熱失活以及蛋白質中的鍵發(fā)生熱裂解，對蛋白質的結構與功能造成不利影響[15]，繼而使得酶活力降低甚至失活。因此，選擇45℃為最佳超聲溫度。

2.2 超聲條件對α-淀粉酶的酶促動力學影響

在超聲功率密度2.85 W/cm3、超聲溫度45℃、超聲時間5 min的處理條件下，探究超聲對α-淀粉酶的酶促動力學影響，與未經超聲處理的α-淀粉酶進行對照。Lineweaver-Burk圖見圖2，根據圖2計算獲得的Vmax和Km值見表1。

圖2 α-淀粉酶的Lineweaver-Burk圖Fig.2 Lineweaver-Burk plot of α-amylase

表1 超聲處理對α-淀粉酶動力學參數的影響Table 1 Effect of ultrasound treatment on kinetic parameters of α-amylase

由圖2和表1可知，與未經過超聲處理的α-淀粉酶相比，超聲處理后的α-淀粉酶的Vmax增加9.56%，Km降低了23.58%。超聲通過提高反應速率、增強酶與底物的結合來促進反應。而超聲使得α-淀粉酶Km減小可能是由于超聲空化產生的壓力、剪切力和溫度，使得α-淀粉酶更多的活性位點暴露，使其易于與底物結合，表現出較強的酶促反應能力[17-18]。試驗結果與研究者利用超聲波技術改善纖維素酶的酶促反應傳質速度所得結論相一致，這種現象是超聲空化引起的機械效應所產生的結果[10]。

2.3 超聲對α-淀粉酶結構的影響

超聲處理后的α-淀粉酶的CD光譜分析結果見圖3，α-淀粉酶的二級結構含量信息見表2。

圖3 超聲處理對α-淀粉酶的CD光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasound treatment on CD spectra of α-amylase

表2 超聲處理對α-淀粉酶的二級結構含量的影響Table 2 Effect of ultrasound treatment on content of secondary structural elements of α-amylase

根據圖3可知，CD光譜在190 nm～200 nm呈現正峰譜帶，這是α-螺旋與β-折疊結構所形成的重合峰，222 nm和208 nm左右的波谷也顯示了α-螺旋結構的存在，同時β-折疊結構在CD光譜中顯示為210 nm～220 nm區(qū)域呈負峰譜帶，205 nm～225nm的CD圖譜顯示主要為α-螺旋和β-折疊疊加的結果[19]。經過超聲處理后，α-淀粉酶的二級結構特征峰的波長沒有發(fā)生明顯位移，但是對應的峰強度發(fā)生了變化。并且結合表2可知，與未經超聲處理樣品相比，α-淀粉酶的α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量降低，β-折疊的含量增加。分析β-折疊含量的增加可能是由α-螺旋和無規(guī)則卷曲結構轉化而來。經過超聲處理后α-淀粉酶的結構含量變化歸因于超聲壓力變化和湍流等誘導的結構轉變[15]，從而可能影響了酶的活性位點。超聲處理使得α-淀粉酶的結構表現得更具有規(guī)律性和柔韌性，同時無規(guī)則卷曲含量的降低使其結構從無序變得更加有序，這不僅能夠提高酶的活性，同時還提高了酶的穩(wěn)定性。

熒光光譜能有效地表征蛋白質及其空間構象的變化，通過對蛋白質的發(fā)色基團進行監(jiān)測，可以有效地判定發(fā)色基團的物理環(huán)境變化以及可能與其發(fā)生共價結合的化學基團的性質，其中以色氨酸的熒光光譜變化為主。超聲處理α-淀粉酶的熒光光譜分析結果見圖4。

圖4 超聲處理對α-淀粉酶的熒光光譜的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment on fluorescence spectra of α-amylase

蛋白質三級結構的變化可以通過分析蛋白質分子表面的色氨酸殘基的熒光強度以及最大吸收波長（λmax）來判定[20-21]。由圖4可知，超聲處理前后的α-淀粉酶的最大吸收波長未發(fā)生明顯位移，表明溫和的超聲場環(huán)境并不會破壞蛋白質的空間結構，且有利于維持α-淀粉酶的活性。而超聲處理后α-淀粉酶熒光強度降低，可能是由于α-淀粉酶表面色氨酸含量的減少。α-淀粉酶經過超聲處理后向外暴露的內部區(qū)域數量的增加，掩埋了原本處于分子表面的色氨酸[22]，因此結果表現為熒光強度降低。研究結果顯示的α-淀粉酶熒光強度降低，與超聲波對葡聚糖酶的影響結果一致[23]，說明溫和的超聲處理條件不僅不會破壞酶分子的空間結構，反而使其三級結構更加整齊有序且提高了酶分子的穩(wěn)定性。低強度的超聲處理能夠誘導蛋白質分子去折疊，破壞蛋白質分子的疏水相互作用，使得α-淀粉酶的三級結構更加整齊有序，并且導致分子內更多的基團和區(qū)域暴露，因此，低強度超聲能夠提高α-淀粉酶酶活力[14]。

3 結論

研究超聲條件對α-淀粉酶的酶活影響的結果表明，與未處理的α-淀粉酶相比，在超聲功率密度2.85 W/cm3、超聲時間5 min、超聲溫度45℃條件下，α-淀粉酶的酶活力提高了22.30%。經超聲處理后得到的α-淀粉酶的水解反應滿足米氏動力學方程，且Km值降低，Vmax值升高。根據圓二色譜和熒光光譜分析結果可知，超聲處理使得α-淀粉酶的二級結構中β-折疊含量上升、無規(guī)則卷曲含量下降，以及表面色氨酸含量降低，超聲處理能夠使得酶分子結構更加整齊和具有規(guī)律性，空間構象發(fā)生了有利轉變，說明超聲對α-淀粉酶酶促反應具有積極的促進作用。研究結果為超聲在酶反應中的應用提供了參考。