郭麗寧，常 蕊，楊 杰，李 惠

(陜西省榆林市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 榆林 719000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)是最常見婦科惡性腫瘤疾病，且近年受宮腔操作及肥胖率、糖尿病發(fā)病率增加等因素影響，此疾病發(fā)病率逐年升高[1]。目前手術(shù)、放化療等是臨床治療EC主要手段，但不同患者獲益不盡相同，原位癌EC復(fù)發(fā)率約20%，Ⅰ期、Ⅱ期EC經(jīng)全切術(shù)后復(fù)發(fā)率可達(dá)50%以上[2]，而探明EC復(fù)發(fā)機(jī)制指導(dǎo)臨床積極完善干預(yù)方案是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。三重基序蛋白14(tripartite motif 14，TRIM 14)是近年新發(fā)現(xiàn)與感染免疫及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，多項(xiàng)研究證實(shí)，其在腫瘤組織內(nèi)異常表達(dá)，參與惡性細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管新生等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)過程[3-4]。微小RNA(microRNA，miR)-335定位在7q32染色體上，其表達(dá)豐度與胃癌、肺癌等多種腫瘤有關(guān)[5-6]。卵巢腺癌擴(kuò)增長(zhǎng)非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA OVAAL)最早發(fā)現(xiàn)于卵巢癌組織，近年相關(guān)研究顯示，其在EC組織內(nèi)高表達(dá)[7]，但其與EC臨床特征及預(yù)后復(fù)發(fā)間關(guān)系如何尚無定論。本研究旨在探討lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM 14在EC中表達(dá)及與臨床特征間關(guān)系，為臨床完善EC復(fù)發(fā)預(yù)警機(jī)制及治療方案提供參考。報(bào)告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2019年1月—2020年12月我院EC患者86例作為癌組織組，同期EP患者86例作為EP組織組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合EC、EP診斷標(biāo)準(zhǔn)[8-9]；②首次確診，入組前未經(jīng)相關(guān)治療；③EC為原發(fā)腫瘤；④無免疫抑制藥物應(yīng)用史；⑤知情研究?jī)?nèi)容，簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤疾病者；②有傳染性疾病者；③合并其他婦科疾病者；④哺乳及妊娠期女性。病例組年齡36～68歲，平均(54.16±6.44)歲；體重指數(shù)18～26，平均22.91±1.33；絕經(jīng)64例，未絕經(jīng)22例；慢性病史：高血壓31例，糖尿病16例，高脂血癥28例。對(duì)照組年齡35～67歲，平均(53.84±6.23)歲；體重指數(shù)18～26，平均22.72±1.34；絕經(jīng)66例，未絕經(jīng)20例；慢性病史：高血壓33例，糖尿病14例，高脂血癥29例。兩組年齡、體重指數(shù)、絕經(jīng)情況、慢性病史基礎(chǔ)資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2檢測(cè)方法 術(shù)中留取EC癌組織、癌旁組織、EP組織，液氮冷凍，研磨，收集細(xì)胞加TRIzol裂解液，提取總RNA，測(cè)RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板，設(shè)置反應(yīng)復(fù)孔(3個(gè))，兩步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，分析循環(huán)閾值，2-△△Ct法獲得最終數(shù)據(jù)。TRIM 14引物序列：上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；lncRNA OVAAL引物序列：上游引物：5′-ACTCAGGCA-TTTTGGGGGAG-3′，下游引物：5′-ATGGCCAC-TTGATGGGTCTG-3′；miR-335引物序列：上游引物：5′-TCAAGAGCAATAACGAAAAATGT-3′,下游引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3′。北京索萊寶科技有限公司提供實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒。

1.3觀察指標(biāo) ①EC癌組織、癌旁組織及EP組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)。②對(duì)比不同臨床特征患者癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)。③比較是否復(fù)發(fā)患者癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)。④比較是否復(fù)發(fā)患者基礎(chǔ)資料。⑤分析EC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素。⑥分析lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)對(duì)1年EC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)，不同特征、是否復(fù)發(fā)患者間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)單因素分析中P<0.05的因素進(jìn)行多重共線性檢驗(yàn)，方差膨脹因子(variance inflation factor，VIF)<5時(shí)認(rèn)為不存在多重共線性，納入Logistic多因素相關(guān)性分析。采用MedCalc 11.4繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)對(duì)EC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值，獲取曲線下面積(areas under the curve，AUC)。Delong非參數(shù)法比較不同AUC差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同組織組lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)的比較 癌組織組、癌旁組織組、EP組織組中l(wèi)ncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。癌組織組lncRNA OVAAL、TRIM14表達(dá)高于癌旁組織組、EP組織組，miR-335表達(dá)低于癌旁組織組、EP組織組(P<0.05)，EP組織組lncRNA OVAAL、TRIM14表達(dá)高于癌旁組織組，miR-335表達(dá)低于癌旁組織組(P<0.05)。見表1。

表1 對(duì)比不同組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)Table 1 Comparison of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 expressions in different tissues

2.2癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14在不同臨床特征組間的表達(dá) lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)在患者年齡、體重指數(shù)、絕經(jīng)、病灶直徑組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、病理類型組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)在不同臨床特征關(guān)組之間的比較 Table 2 Comparison of the expression of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 in cancer tissues in groups with different clinical characteristics

表2 (續(xù))

2.3是否復(fù)發(fā)患者間lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá) 86例患者隨訪1年，失訪3例，有效隨訪83例，復(fù)發(fā)17例，復(fù)發(fā)率為20.48%。復(fù)發(fā)患者癌組織lncRNA OVAAL、TRIM14表達(dá)高于未復(fù)發(fā)患者，miR-335表達(dá)低于未復(fù)發(fā)患者(P<0.05)。見表3。

表3 對(duì)比是否復(fù)發(fā)患者間lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)Table 3 Comparison of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 expressions between patients with or without recurrence

2.4EC復(fù)發(fā)的單因素分析 是否復(fù)發(fā)患者FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、淋巴結(jié)清掃范圍比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 EC復(fù)發(fā)的單因素分析Table 4 Univariate analysis of EC recurrence (例數(shù)，%)

2.5EC復(fù)發(fā)的多因素分析 以術(shù)后是否復(fù)發(fā)作為因變量，以2.3及2.4中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)目作為自變量，經(jīng)多重共線性檢驗(yàn)不存在共線性可能(VIF<5)，具體賦值見表5。納入Logistic回歸模型，結(jié)果顯示，校正FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、淋巴結(jié)清掃范圍后，lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)為EC復(fù)發(fā)的影響因素(P<0.05)。見表6。

表5 賦值Table 5 Assignment

2.6lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14對(duì)EC復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14預(yù)測(cè)EC復(fù)發(fā)的AUC分別為0.851、0.875、0.848。三者聯(lián)合預(yù)測(cè)EC復(fù)發(fā)的AUC為0.915最大。見表7、圖1。

圖1 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14對(duì)EC復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值

表6 EC復(fù)發(fā)的多因素分析Table 6 Multivariate analysis of EC recurrence

表7 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14對(duì)EC復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值Table 7 Predictive value of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 for EC recurrence

3 討 論

EC病因病機(jī)尚未完全明確，目前認(rèn)為可能與雌激素刺激、抑癌基因失活有關(guān)[10]。盡管近年隨診斷技術(shù)進(jìn)步，EC早期診斷率顯著升高，使得此類患者5年生存率得以提高，但如何根據(jù)腫瘤生物學(xué)特性合理制定治療方案進(jìn)一步提升患者獲益仍是困擾臨床一大難題。

miRNA是長(zhǎng)度18～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性RNA，其高度保守性，且能調(diào)控機(jī)體基因表達(dá)。研究證實(shí)，miRNA與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等各種病理生理過程的調(diào)控有關(guān)，且參與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過程。miR-335是近年新發(fā)現(xiàn)在胃癌、乳腺癌、膽囊癌等腫瘤組織內(nèi)，尤其是各種生殖系統(tǒng)腫瘤中呈低表達(dá)的一種miRNA，且國內(nèi)也有研究指出，EC患者外周血miR-335水平降低，但其在EC組織內(nèi)表達(dá)及與EC臨床特征間關(guān)系如何仍無定論[11-14]。lncRNA一向被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄生成的副產(chǎn)物，無實(shí)際生物活性，但近年隨研究深入發(fā)現(xiàn)，其存在多重調(diào)控功能，參與轉(zhuǎn)錄、修飾等多個(gè)過程的編碼蛋白基因調(diào)控過程，且與細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞代謝等過程密切相關(guān)。lncRNA OVAAL是lncRNA家族新發(fā)現(xiàn)成員，學(xué)者研究證實(shí)，在子宮內(nèi)膜漿液性乳頭狀癌患者外周血內(nèi)lncRNA OVAAL水平顯著升高[15]。本研究推測(cè)，miR-335、lncRNA OVAAL可能在EC發(fā)生發(fā)展中分別發(fā)揮抑癌基因、促癌基因作用。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癌組織miR-335表達(dá)顯著降低，lncRNA OVAAL表達(dá)顯著升高，且二者在EP組織中亦存在一定程度異常表達(dá)，此特征符合上述miR-335、lncRNA OVAAL生物學(xué)行為特性的推測(cè)，亦符合EP存在惡變風(fēng)險(xiǎn)的特征，提示miR-335低表達(dá)、lncRNA OVAAL高表達(dá)可能在一定程度上促進(jìn)EC的發(fā)生發(fā)展。繼續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-335、lncRNA OVAAL表達(dá)與EC病理類型、FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與是否絕經(jīng)、病灶直徑、年齡、體重指數(shù)等無關(guān)，反映二者表達(dá)不易受個(gè)體因素影響，或可作為EC生物學(xué)行為的補(bǔ)充為臨床評(píng)估EC病理特征及明確其復(fù)發(fā)機(jī)制提供重要信息。但EC發(fā)生發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸涉及因素、病理生理機(jī)制眾多，而miR-335、lncRNA OVAAL對(duì)EC復(fù)發(fā)的影響是否存在獨(dú)立性仍未明確。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，校正混雜因素后，miR-335、lncRNA OVAAL仍進(jìn)入方程，客觀說明miR-335、lncRNA OVAAL是EC復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素。分析主要原因是正常情況下，miRNA的表達(dá)嚴(yán)格遵守組織及時(shí)序特異性，而病理狀態(tài)下miRNA異常表達(dá)，如：miR-335可通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變而降低細(xì)胞運(yùn)動(dòng)活性，限制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，而其表達(dá)降低時(shí)可正調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄因子SOX4胞外鈣黏蛋白C表達(dá)繼而利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲[16]；lncRNA OVAAL可強(qiáng)制腫瘤基因擴(kuò)增，與腫瘤細(xì)胞常見致癌基因DNA拷貝數(shù)變異現(xiàn)象一致，能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化，促使細(xì)胞無序增殖，而EC的惡性行為可能僅是miR-335、lncRNA OVAAL異常表達(dá)后的一種直觀呈現(xiàn)[17]。因此，miR-335、lncRNA OVAAL可從分子層面為臨床評(píng)估EC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)提供更客觀的依據(jù)。

TRIM 14是TRIMs家族重要成員，其主要特征是包括一系列保守結(jié)構(gòu)域，參與細(xì)胞增殖及凋亡、免疫及炎癥等眾多細(xì)胞生理病理過程[18]。有研究顯示，下調(diào)TRIM 14表達(dá)能促使細(xì)胞凋亡，遏制乳腺癌細(xì)胞增殖，但其沉默可顯著強(qiáng)化肺癌細(xì)胞增殖活性。上述研究反映，不同腫瘤內(nèi)TRIM 14表達(dá)不一，既充當(dāng)癌因子又具有抑癌因子活性[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織TRIM14高表達(dá)，且與FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有關(guān)，提示TRIM14可能在EC中發(fā)揮促癌基因作用。此外，有學(xué)者研究顯示，TRIM 14高表達(dá)的EC患者5年總生存期較短[21]，從側(cè)面印證本研究結(jié)論。繼續(xù)多因素Logstic回歸分析發(fā)現(xiàn)，TRIM 14高表達(dá)同樣是EC復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)合現(xiàn)有研究分析TRIM 14可能是通過特殊結(jié)構(gòu)域-PRYSPRY實(shí)現(xiàn)E3泛素化酶作用而激活NF-κB通路繼而影響腫瘤細(xì)胞的增值、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等活性而增加EC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[22]。ROC分析顯示，lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14聯(lián)合預(yù)測(cè)EC復(fù)發(fā)的AUC值達(dá)0.915，具有較高預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，EC患者癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達(dá)與FIGO分期、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、病理類型等特征有關(guān)，三者聯(lián)合可有效提升術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)效能。從lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM 14生物學(xué)特性分析不難發(fā)現(xiàn)，三者在EC發(fā)生發(fā)展中可能存在某種交互關(guān)系，盡管本研究經(jīng)多重共線性檢驗(yàn)，三者間無共線性關(guān)系，但受于樣本來源單一及樣本量小等因素影響，仍不排除結(jié)果間互相干擾影響結(jié)論的客觀性，仍需后期繼續(xù)探討。