王立宇 劉淑云 肖茂春 楊麗 殷澤登

急性缺血性腦卒中發(fā)病率近年來不斷增加，嚴(yán)重危害患者健康，其中約20%～25%發(fā)生在椎-基底動脈系統(tǒng)(又稱后循環(huán))[1]。細胞缺血損傷的本質(zhì)為能量代謝障礙[2]。線粒體是細胞能量產(chǎn)生的主要來源，研究發(fā)現(xiàn)，腦細胞缺血缺氧能夠促進線粒體自噬的產(chǎn)生，抑制線粒體自噬會加重缺血缺氧的損傷程度，可見線粒體自噬在腦細胞缺血缺氧中發(fā)揮著重要作用[3]。目前，急性后循環(huán)缺血(posterior circulation ischemia，PCI)腦細胞線粒體自噬的變化規(guī)律還需要進一步研究。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator1，SIRTl)-PTEN誘導(dǎo)激酶1(PTEN-induced kinase 1，PINK1)信號通路在線粒體自噬過程中發(fā)揮重要作用[4]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是線粒體自噬的標(biāo)志性蛋白質(zhì)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針可提高聽皮層葡萄糖代謝[5]。本研究擬通過阻斷豚鼠右側(cè)頸總動脈和右側(cè)鎖骨下動脈建立急性后循環(huán)缺血豚鼠模型，探討急性后循環(huán)缺血對豚鼠蝸神經(jīng)核能量代謝、SIRT1-PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬的影響，以及電針的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 40只健康雜色2～3月齡豚鼠，體重198.50～426.00 g，隨機分為四組，分別為：手術(shù)+電針組(簡稱電針組)、手術(shù)組、對照組和假手術(shù)組，每組10只。豚鼠均由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供(生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2018-17；使用許可證號：SYXK(川)2018-065)。

1.2實驗方法

1.2.1急性后循環(huán)缺血豚鼠模型建立 SD大鼠與豚鼠血管解剖相似，參照劉陽等[6]的方法建立急性后循環(huán)缺血模型。手術(shù)組和電針組豚鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)，待麻醉滿意后，取仰臥位固定，剪開頸前皮膚，鈍性分離肌肉，氣管旁定位找到右側(cè)頸動脈鞘，暴露并分離右側(cè)頸總動脈，隨后雙重結(jié)扎并切斷，沿右側(cè)頸總動脈向胸腔內(nèi)走向可見其與右側(cè)鎖骨下動脈的分叉，用彎鑷仔細勾出右側(cè)鎖骨下動脈，隨后穿線結(jié)扎，逐層縫合皮膚。假手術(shù)組豚鼠同法暴露右側(cè)頸總動脈、右側(cè)鎖骨下動脈，但不做離斷和結(jié)扎；對照組自然喂養(yǎng)。

1.2.2電針方法 電針組術(shù)后七天清醒狀態(tài)下每日使用HM6805-Ⅰ型經(jīng)穴治療儀(HM6805-Ⅰ型，1100801072，四川恒明科技開發(fā)有限公司)電針刺激豚鼠百會穴及雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴(李辭蓉等，1992)，以0.4～0.6 mA強度、14 Hz頻率的疏密波持續(xù)刺激30 min，每天1次，連續(xù)7天，刺激強度以豚鼠出現(xiàn)電針部位及四肢的輕微抖動但不掙扎嘶叫為宜。

1.2.3Micro PET/CT顯像 7天后每組豚鼠掃描頭部Micro PET/CT(SIEMENS Inveon MM，西門子公司)。參照Liu等[5]的方法完成掃描和圖像重建、校正，獲得CT、PET及兩者融合圖像，在同一平面上分別勾畫出各組豚鼠雙側(cè)耳蝸神經(jīng)核團的感興趣區(qū)域(Schofield等，2005)，測量其攝取18F-FDG的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(maximum standardized uptake values，SUVmax)，以蝸神經(jīng)核團SUVmax左側(cè)/右側(cè)的平均比值分析各組葡萄糖代謝情況。

1.2.4標(biāo)本取材 于Micro PET/CT檢測后，注射10%水合氯醛全麻滿意后斷頭，暴露腦組織，置于冰上，按照參考文獻去除豚鼠顱骨，暴露大腦、小腦組織并小心去除，在腦干外側(cè)可見解剖形狀類圓形的組織，蝸神經(jīng)進入顱內(nèi)腦干部分定位豚鼠蝸神經(jīng)核(Schofield等，2005)，取出右側(cè)蝸神經(jīng)核，迅速放入凍存管內(nèi)，儲存于-80℃冰箱中備用。

1.2.5ELISA法檢測蝸神經(jīng)核ATP水平 蝸神經(jīng)核組織稱重后于液氮中研磨，按照購買的ATP試劑盒(A095-1-1，南京建成)的步驟進行操作，獲得混合液，使用酶標(biāo)儀測定 OD450最大吸收波長。

1.2.6實時熒光定量PCR檢測蝸神經(jīng)核PINK1、SIRT1、LC3 mRNA的表達 蝸神經(jīng)核組織稱重后于液氮中研磨，按照RNA提取試劑盒(15596018，美國invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(G492，abm公司)的說明書分別提取RNA、獲得cDNA。按照熒光定量PCR試劑盒(0194844830001，abm公司)說明書，以GAPDH mRNA為內(nèi)參基因，檢測PINK1、SIRT1、LC3 mRNA(引物序列見表1)的表達。

表1 引物序列

2 結(jié)果

手術(shù)麻醉清醒后，手術(shù)組、電針組分別有7只、8只豚鼠出現(xiàn)急性后循環(huán)缺血癥狀，即向左側(cè)持續(xù)翻滾、頭偏斜明顯、后肢外展，倦臥少動，反應(yīng)能力下降，自發(fā)活動量減少，進食進水量減少；手術(shù)組、電針組分別有3只、2只僅出現(xiàn)倦臥少動，反應(yīng)能力下降，自發(fā)活動量減少，進食進水量減少；假手術(shù)組有3只豚鼠出現(xiàn)倦臥少動，反應(yīng)能力下降，自發(fā)活動量減少，進食進水量減少。對照組豚鼠未見上述癥狀。

2.1各組豚鼠蝸神經(jīng)核葡萄糖代謝變化 四組豚鼠蝸神經(jīng)核的葡萄糖代謝PET/CT顯像情況見圖1，四組左右兩側(cè)蝸神經(jīng)核SUVmax平均比值見表2，可見四組間蝸神經(jīng)核SUVmax平均比值相比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=18.757，P<0.001)。

圖1 四組豚鼠蝸神經(jīng)核的葡萄糖代謝PET/CT顯像情況

2.2蝸神經(jīng)核ATP水平變化 四組右側(cè)蝸神經(jīng)核的ATP水平見表2,可見四組間右側(cè)蝸神經(jīng)核的ATP水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=369.129，P<0.001)。

2.3四組蝸神經(jīng)核SIRT1、LC3、PINK1的mRNA表達變化 四組SIRT1、LC3、PINK1的mRNA相對表達量見表3,可見,四組間豚鼠蝸神經(jīng)核PINK1 mRNA和LC3 mRNA相對表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義

表2 四組豚鼠蝸神經(jīng)核SUVmax左/右平均比值

(F=1.192，P=0.327;F=0.762，P=0.523)；SIRT1 mRNA相對表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FSIRT1=3.374，P=0.029)。

表3 四組豚鼠右側(cè)蝸神經(jīng)核SIRT1、LC3、PINK1的mRNA相對表達變化情況

3 討論

3.1急性后循環(huán)缺血對蝸神經(jīng)核能量代謝的影響及機制 劉陽等[6]通過手術(shù)結(jié)扎右側(cè)頸總動脈及右側(cè)鎖骨下動脈,大鼠出現(xiàn)左側(cè)持續(xù)翻滾、頭偏斜明顯、后肢外展、倦臥少動等急性后循環(huán)缺血癥狀，缺血明顯且持久穩(wěn)定;故本研究參照此方法建立后循環(huán)缺血豚鼠模型，且建模成功。

PET/CT是定量研究活體神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)和功能變化的重要方法[7，8]。在本研究中，18F-FDG PET/CT分子成像結(jié)果顯示，急性PCI豚鼠蝸神經(jīng)核SUVmax左/右平均比值升高，這證實急性后循環(huán)缺血后右側(cè)蝸神經(jīng)核的葡萄糖代謝水平明顯降低。葡萄糖是大腦主要的能量來源，ATP是腦組織唯一能夠直接利用的能量形式。本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，手術(shù)組缺血側(cè)蝸神經(jīng)核ATP水平明顯降低。既往研究表明，當(dāng)血管內(nèi)血流量降低時，正常需求量的葡萄糖無法到達靶組織[9]，導(dǎo)致ATP合成減少，最終導(dǎo)致細胞死亡[10]。Ravindran等[11]發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸動脈閉塞大鼠大腦區(qū)域的線粒體內(nèi)ATP水平顯著降低。趙汝舟等[12]研究發(fā)現(xiàn)缺氧/復(fù)氧可導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)活性氧生成增加，ATP產(chǎn)生減少，導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果與此一致。

SIRT1信號通路對線粒體質(zhì)量和數(shù)量的調(diào)節(jié)起著重要的作用，是能量代謝中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[13]。本實驗中，急性后循環(huán)缺血豚鼠右側(cè)蝸神經(jīng)核SIRT1 mRNA表達升高，暗示SIRT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可能參與了急性缺血缺氧后蝸神經(jīng)核能量代謝功能重塑過程。當(dāng)能量降低時，NAD+濃度增加，從而增強了SIRT1的NAD+脫乙酰酶活性。Wan等[14]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)SIRT1 信號通路提供神經(jīng)保護作用，降低腦缺血損傷。Zhu等[15]通過實驗發(fā)現(xiàn)，三七皂苷可激活NAMPT-NAD+-SIRT1級聯(lián)反應(yīng)來促進缺血性腦卒中后血管生成。上調(diào)SIRT1表達然后促進AMPK激活可以預(yù)防神經(jīng)元死亡進而預(yù)防缺血性卒中[16]。本研究結(jié)果表明，SIRT1可能參與了急性后循環(huán)缺血豚鼠蝸神經(jīng)核能量代謝功能的重塑過程。

3.2電針對急性后循環(huán)缺血蝸神經(jīng)核能量代謝功能重塑的影響及機制 本實驗中，電針組豚鼠SUVmax左/右平均比值降低，ATP生成水平升高，這證實電針百會穴和內(nèi)關(guān)穴后缺血側(cè)蝸神經(jīng)核的葡萄糖代謝水平和ATP生成水平均升高。既往研究表明，針刺能降低腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損評分，同時能有效維持線粒體超微結(jié)構(gòu)[17]。針刺還有利于維持細胞內(nèi)外離子的穩(wěn)定，對抗自由基損傷和脂質(zhì)過氧化，影響細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、腦細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡調(diào)節(jié)基因[18]。因此，電針可有效改善急性后循環(huán)缺血豚鼠蝸神經(jīng)核能量代謝功能。

本研究結(jié)果顯示，與手術(shù)組比較，電針組SIRT1 mRNA表達降低。一方面，急性后循環(huán)缺血后豚鼠蝸神經(jīng)核通過自身的代償功能增加葡萄糖代謝；另一方面，電針也可能通過加速蝸神經(jīng)核的血流量，增強葡萄糖代謝功能。葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制不允許能量代謝水平無限制提升。有研究證明NAD+是一種關(guān)鍵的氧化還原輔酶，當(dāng)組織能量逐漸升高時，NAD+濃度降低，從而使SIRT1的NAD+脫乙酰酶活性減弱[19]。本研究中四組豚鼠蝸神經(jīng)核PINK1 mRNA和LC3 mRNA相對表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，SIRT1-PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬在急性后循環(huán)缺血豚鼠蝸神經(jīng)核能量代謝功能重塑過程中的作用還需要進一步研究證實。

綜上所述，電針百會穴和內(nèi)關(guān)穴可以改善急性后循環(huán)缺血豚鼠蝸神經(jīng)核葡萄糖的代謝功能，提高ATP生成水平。電針百會穴和內(nèi)關(guān)穴可能通過調(diào)節(jié)SIRT1的表達促進急性后循環(huán)缺血豚鼠蝸神經(jīng)核能量代謝功能的重塑過程。SIRT1-PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬在急性后循環(huán)缺血豚鼠蝸神經(jīng)核葡萄糖代謝和功能重塑中的作用尚未完全厘清，未來可設(shè)置更多的觀測時間點，并應(yīng)用Western blot技術(shù)在蛋白水平上針對目標(biāo)基因進一步驗證。