鐘梅芳 馬秋林 李楚凌 盧炫廷

縫隙連接蛋白基因GJB2是導(dǎo)致常染色體隱性遺傳非綜合征型聾的最常見原因[1]。其中，GJB2基因c.109G>A/p.Val37Ile(以下簡(jiǎn)稱p.V37I)變異位點(diǎn)，不僅在很多耳聾患者中被檢測(cè)出來，也存在于聽力正常的個(gè)體中。它廣泛存在于東亞人群中，在我國(guó)廣東省人群中的等位基因頻率高達(dá)11.61%[2]。p.V37I的耳聾致病性一直備受爭(zhēng)議，但目前已被美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)和分子病理學(xué)協(xié)會(huì)(ACMG/AMP)指南明確劃分為耳聾致病變異位點(diǎn)[3]。由于p.V37I相關(guān)的聽力表型具有不完全外顯和變異度較大的特點(diǎn)，對(duì)經(jīng)典的孟德爾遺傳病在臨床解釋上提出了重大挑戰(zhàn)[1]。目前，關(guān)于GJB2 p.V37I致病變異最普遍存在的廣東人群中的聽力表型信息報(bào)道比較少，本研究通過對(duì)廣東東莞地區(qū)210例攜帶GJB2基因p.V37I純合及復(fù)合雜合變異嬰兒的聽力篩查、診斷及隨訪結(jié)果進(jìn)行總結(jié)和分析，獲得其聽力表型信息，以進(jìn)一步了解和評(píng)價(jià)GJB2 p.V37I基因變異對(duì)東莞地區(qū)兒童聽力損失的影響，為臨床耳聾基因診斷與遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 以2018年1月至2021年1月期間，來自東莞地區(qū)20家醫(yī)院出生的且耳聾基因篩查或測(cè)序結(jié)果為GJB2基因p.V37I純合或復(fù)合雜合變異，并均在東莞市新生兒聽力障礙診治中心接受耳聾遺傳咨詢和聽力檢測(cè)的嬰兒210例為研究對(duì)象,臨床聽力學(xué)資料完整,其中男115例，女95例；東莞市戶籍123例，省內(nèi)非本市戶籍24例，外省戶籍63例；出生時(shí)有聽力損失高危因素46例，其中25例有病理性黃疸(未達(dá)到換血治療程度)，早產(chǎn)兒5例，新生兒肺炎4例，足月小樣兒3例，宮內(nèi)感染3例，羊水吸入綜合征3例，3例出生時(shí)因母親孕期合并心臟病、重度子癇和膿毒血癥入住新生兒監(jiān)護(hù)病房，其余164例為出生正常嬰兒。

1.2耳聾基因檢測(cè)方法 210例出生后均接受了耳聾基因篩查，其中204例(97.14%，204/210)出生后接受了聽力聯(lián)合耳聾基因同步篩查，其余6例是在1歲以內(nèi)聽力學(xué)診斷異常后進(jìn)行了耳聾基因篩查及測(cè)序。Sanger測(cè)序檢測(cè)是使用廣東凱普生物科技股份有限公司的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)對(duì)GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA12SrRNA的4個(gè)基因的目標(biāo)位置進(jìn)行擴(kuò)增，并采用特異性引物進(jìn)行檢測(cè)。引物見表1，特異性引物的設(shè)計(jì)是專門針對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)，并覆蓋該位點(diǎn)上下游的序列。對(duì)標(biāo)本檢測(cè)得到的序列與NCBI所提供的上述4個(gè)基因參考序列，使用生物信息學(xué)軟件Alamut Visual 2.11進(jìn)行比對(duì)和注釋。對(duì)突變的表述參照HGVS (Human Genome Variation Society) version 15.11進(jìn)行。

表1 檢測(cè)GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA 12SrRNA 4個(gè)基因的PCR引物

1.3聽力檢測(cè)方法 根據(jù)相關(guān)指南[4]，對(duì)出生后2～3天的新生兒在出生醫(yī)院采用耳聲發(fā)射(OAE)或自動(dòng)聽性腦干反應(yīng)(AABR)完成聽力初篩；初篩未通過者于出生后42天內(nèi)轉(zhuǎn)診至東莞市新生兒聽力障礙診治中心進(jìn)行復(fù)篩，采用畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)和AABR聯(lián)合測(cè)試；復(fù)篩未通過者于3月齡進(jìn)行第一次聽力診斷，使用氣導(dǎo)聽性腦干反應(yīng)(ABR)+聲導(dǎo)抗+DPOAE+行為測(cè)聽的基本組合聽力測(cè)試；首次聽力診斷異常者于6月齡進(jìn)行第二次聽力診斷，根據(jù)患兒聽力損失的情況在基本組合聽力測(cè)試項(xiàng)目上追加骨導(dǎo)ABR和聽性穩(wěn)態(tài)反應(yīng)(ASSR)測(cè)試等，具體測(cè)試設(shè)備與參數(shù)設(shè)置見文獻(xiàn)報(bào)道[5]。所有研究對(duì)象的基本信息與聽力篩查診斷結(jié)果均錄入東莞市新生兒聽力篩查系統(tǒng)，以便對(duì)患兒的跟蹤隨訪和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.4聽力診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，將嬰兒聽力診斷正常標(biāo)準(zhǔn)定為：①氣導(dǎo)短聲ABR波V反應(yīng)閾<35 dB nHL；②1 000 Hz探測(cè)音鼓室導(dǎo)抗圖為正峰型；③DPOAE測(cè)試有≥5個(gè)頻率點(diǎn)的信噪比≥6 dB，且幅值在正常范圍內(nèi)；④行為測(cè)聽聽閾參考對(duì)應(yīng)月齡的正常值。依照ABR波V反應(yīng)閾值，將聽力損失程度劃分為四個(gè)等級(jí)：輕度(31～50 dB nHL)、中度(51～70 dB nHL) 、重度(71～90 dB nHL)和極重度聽力損失(≥91 dB nHL)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以頻數(shù)(n)或百分率(%)表示，兩組的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1耳聾基因檢測(cè)結(jié)果 210例嬰兒中，194例(92.38%，194/210)為GJB2基因p.V37I純合變異，15例(7.14%，15/210)為GJB2基因p.V37I/c.235delC復(fù)合雜合變異，1例為GJB2基因p.V37I/c.79G>A/ c.23C>T的3位點(diǎn)復(fù)合雜合變異。

2.2聽力檢測(cè)結(jié)果

2.2.1聽力初篩及復(fù)篩結(jié)果 210例中，初篩未通過166例(79.05%，166/210),其中146例進(jìn)行了聽力復(fù)篩，未通過共84例(57.14%，84/146)。在兩步篩查中，初篩通過44例和復(fù)篩通過62例，共106例(50.48%,106/210)通過聽力篩查。

2.2.2聽力診斷結(jié)果 210例(420耳)中，88例進(jìn)行第一次聽力學(xué)診斷，66例(111耳)氣導(dǎo)短聲ABR波V反應(yīng)閾>35 dB nHL和DPOAE未引出，診斷為聽力異常，其中4例(4耳)耳內(nèi)鏡檢查顯示中耳腔積液征和1 000 Hz鼓室導(dǎo)抗圖無(wú)峰型，其余嬰兒1 000 Hz鼓室導(dǎo)抗圖為有峰型。

第一次聽力診斷異常的66例中55例接受了第二次聽力診斷和相關(guān)醫(yī)學(xué)評(píng)估，其中,43例(75耳)(17.86%,75/420)診斷為聽力異常,75耳均為DPOAE未引出和1 000 Hz鼓室導(dǎo)抗圖正峰，其中1例(2耳)ABR測(cè)試顯示存在明顯的骨-氣導(dǎo)差,表現(xiàn)為傳導(dǎo)性聽力損失，其余均為感音神經(jīng)性聽力損失；67耳(89.33%,67/75)為輕度聽力損失，1例單側(cè)和1例雙側(cè)(4%,3/75)中度聽力損失，3例單側(cè)和1例雙側(cè)(6.67%,5/75)為重度及以上聽力損失。對(duì)比第一次聽力診斷的結(jié)果，第二次聽力診斷為輕度聽力損失的人數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 66例GJB2基因p.V37I純合及復(fù)合變異嬰兒不同聽力損失程度在二次聽力診斷的分布(耳,%)

2.2.3聽力損失較重病例的隨訪結(jié)果 本研究最終共檢出6例(8耳)中度及以上聽力損失患兒，其中2例單側(cè)聾患兒尚未完善耳聾基因診斷及影像學(xué)評(píng)估，4例接受了Sanger測(cè)序分析和內(nèi)耳MRI或顳骨CT檢查，最后一次的聽力隨訪結(jié)果如下。

病例1：男，無(wú)聽力損失高危因素，聽力初復(fù)篩雙耳均未通過，3月齡和6月齡時(shí)，左側(cè)氣導(dǎo)ABR反應(yīng)閾100 dB nHL未引出,右側(cè)100 dB nHL，ASSR預(yù)估聽力圖(圖1a)為雙耳極重度感音神經(jīng)性聽力損失?；蚝Y查和Sanger測(cè)序分析為GJB2基因p.V37I純合變異，內(nèi)耳MRI平掃M(jìn)RN(圖2a1和2a2)示左側(cè)前庭擴(kuò)大并與水平半規(guī)管融合，右側(cè)前庭稍擴(kuò)大和半規(guī)管稍擴(kuò)張，考慮先天性發(fā)育畸形。于7月齡時(shí)已行右側(cè)人工耳蝸植入術(shù)。

病例2：女，無(wú)聽力損失高危因素，聽力初復(fù)篩左耳未通過，3月齡和6月齡時(shí)診斷為左耳重度感音神經(jīng)性聽力損失,左側(cè)氣導(dǎo)ABR反應(yīng)閾90 dB nHL,ASSR預(yù)估聽力圖呈明顯高頻陡降型(圖1b)?；蚝Y查和Sanger測(cè)序分析為GJB2基因p.V37I純合變異和GJB3基因c.357C>T雜合變異，內(nèi)耳MRI(圖2b1和2b2)發(fā)現(xiàn)左側(cè)蝸神經(jīng)未顯示，左側(cè)耳蝸頂回略小。目前，該患兒未行任何聽力干預(yù)。

病例3：男，無(wú)聽力損失高危因素，聽力初復(fù)篩雙耳均未通過，3月齡和7月齡時(shí),雙側(cè)氣導(dǎo)ABR測(cè)試時(shí)引出聲誘發(fā)短潛伏期負(fù)反應(yīng)波(ASNR)，且存在約30～40 dB的氣-骨導(dǎo)差(圖1c1和1c2)，ASSR預(yù)估聽力圖為雙耳中度聽力損失(圖1c3)?；蚝Y查和Sanger測(cè)序分析為GJB2基因p.V37I純合變異和SLC26A4基因c.2086C>T雜合變異，顳骨CT掃描(圖2c1和2c2)發(fā)現(xiàn)雙側(cè)大前庭水管增寬，并直接與總腳相遇，雙側(cè)耳蝸發(fā)育異常，診斷為大前庭水管綜合征(LVAS)，目前雙耳佩戴助聽器和進(jìn)行言語(yǔ)康復(fù)訓(xùn)練。

病例4：女，出生時(shí)有病理性黃疸行藍(lán)光治療，聽力初篩左耳未通過,右耳通過，復(fù)篩雙耳均未通過;1歲時(shí)左側(cè)氣導(dǎo)ABR反應(yīng)閾55 dB nHL，右側(cè)45 dB nHL，ASSR預(yù)估聽力圖為左耳中度和右耳輕度聽力損失(圖1d)?；蚝Y查和Sanger測(cè)序分析為GJB2基因p.V37I純合突變，顳骨CT平掃+重建未見明顯異常。目前，該患兒未行任何聽力干預(yù)。

圖1 4例患兒的聽力測(cè)試圖 a.患兒1的ASSR; b.患兒2的ASSR; c1.患兒3的氣導(dǎo)ABR; c2.患兒3的骨導(dǎo)ABR; c3.患兒3的ASSR; d.患兒4的ASSR

圖2 3例患兒的影像學(xué)圖像 a1.患兒1內(nèi)耳MRI平掃M(jìn)RN顯示左側(cè)前庭擴(kuò)大并與水平半規(guī)管融合(短箭頭),右側(cè)前庭稍擴(kuò)大(長(zhǎng)箭頭); a2.患兒1右側(cè)半規(guī)管稍擴(kuò)張(長(zhǎng)箭頭); b1.患兒2 MRI斜矢狀面內(nèi)耳道成像顯示左側(cè)內(nèi)耳道未見蝸神經(jīng)(長(zhǎng)箭頭); b2.患兒2右側(cè)內(nèi)耳道蝸神經(jīng)(長(zhǎng)箭頭); c1.患兒3顳骨CT掃描顯示雙側(cè)前庭水管增寬(長(zhǎng)箭頭); c2.患兒3雙側(cè)前庭直接與總腳相遇(長(zhǎng)箭頭),雙側(cè)耳蝸發(fā)育異常

3 討論

GJB2基因位于人類染色體13q11-12，含有2個(gè)外顯子，編碼的縫隙連接蛋白26(Cx26)屬于完整膜蛋白的連接蛋白家族，對(duì)耳蝸支持細(xì)胞的功能至關(guān)重要。當(dāng)發(fā)生DFNB1位點(diǎn)突變，無(wú)論是純合或復(fù)合雜合突變，使GJB2基因的兩個(gè)等位基因失活，導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性聾[7]。GJB2是一個(gè)小基因，但有很多突變。至今為止，已發(fā)現(xiàn)有200多個(gè)GJB2變異位點(diǎn)與常染色體隱性遺傳非綜合征型聾相關(guān)，其常見的突變熱點(diǎn)往往存在明顯的種族差異，而且不同突變的聽力表型可能差異很大[7]。GJB2基因p.V37I剛開始被認(rèn)為非致病突變[8]，然而大量研究已證實(shí)它是一個(gè)廣泛存在于東亞人群的致病變異[9]，目前已獲得我國(guó)藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批號(hào)的耳聾基因篩查試劑盒中的變異位點(diǎn)[10]。

研究表明[11,12]，p.V37I變異是GJB2基因非截?cái)嗤蛔冎械腻e(cuò)義突變，僅導(dǎo)致耳蝸外毛細(xì)胞微小損失或蛋白功能部分降低，但大體上不影響耳蝸細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及縫隙連接蛋白的形成與定位，故p.V37I的致病性和外顯率較低。本研究發(fā)現(xiàn)210例GJB2基因p.V37I純合及復(fù)合雜合變異嬰兒中，有106例(50.48%，106/210)可通過兩步篩查;以往研究[13-15]亦報(bào)道p.V37I純合或復(fù)合雜合變異嬰兒聽力篩查通過率26.67%～53.85%，說明p.V37I變異外顯率較低，尤其在新生兒聽力篩查中存在一定比例的“不外顯”。另外，本組對(duì)象中有22例p.V37I變異攜帶者兩次聽力篩查皆未通過但第一次聽力學(xué)診斷為正常;還有12例雖然首次聽力診斷為輕中度聽力損失但第二次聽力診斷為正常，尤其是輕度聽力損失者的比例較多。推測(cè)可能由于出生后外中耳殘留羊水、胎脂或發(fā)生常見的嬰兒分泌性中耳炎，經(jīng)過治療或自愈后中耳功能改善從而聽力好轉(zhuǎn)；也可能存在低月齡嬰兒聽覺功能發(fā)育遲緩，隨著月齡增長(zhǎng)聽力隨之改善。

p.V37I變異不僅外顯率較低，且引起的聽力損失主要為輕度至中度感音神經(jīng)性聽力損失[14-17]。本研究中，經(jīng)過“兩次診斷”后確診為聽力損失者43例(75耳)，檢出率為17.86%(75/420)，與Chai等[18]推斷p.V37I純合突變約有17%的外顯率接近。這75耳聽力損失耳中，輕度聽力損失67耳(89.33%，67/75)，而中度聽力損失僅3耳(4%，3/75)，比既往文獻(xiàn)報(bào)道的聽力損失程度及比例要低，可能與本研究對(duì)象的地區(qū)不同及年齡較小等有關(guān)。

p.V37I變異引起的聽力表型變異較大，可為聽力正常，也可為輕度至極重度感音神經(jīng)性聽力損失，但發(fā)生嚴(yán)重聽力損失的比例較少[18]。本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)6例(8耳)中度及以上聽力損失嬰兒，隨訪中發(fā)現(xiàn)3例同時(shí)攜帶其他基因變異或合并內(nèi)耳或神經(jīng)發(fā)育畸形。Del等[7]的文獻(xiàn)綜述表明GJB2基因DFNB1聽力損失患者中較少出現(xiàn)顳骨畸形，其患病率通常低于10%。因此，考慮個(gè)別嚴(yán)重聽力損失的p.V37I變異病例可能是由于存在其他基因變異或病因，建議進(jìn)行分子遺傳學(xué)和影像學(xué)等全面評(píng)估。

綜上所述，本組東莞地區(qū)攜帶GJB2基因p.V37I純合及復(fù)合雜合變異的嬰兒中，聽力損失的檢出率為17.86%，聽力表型外顯率較低，而且變異較大。值得關(guān)注的是，已有不少文獻(xiàn)[13，14]報(bào)道p.V37I變異與兒童遲發(fā)性和漸進(jìn)性聽力損失有關(guān)。因此，在臨床中須重視包括p.V37I基因在內(nèi)的遺傳性聾易感基因篩查，對(duì)基因變異攜帶者即使通過聽力篩查或聽力正常也應(yīng)注意隨訪，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其聽力。但是，由于本研究對(duì)出生后一年內(nèi)嬰兒的耳聾基因篩查和聽力資料進(jìn)行總結(jié)與分析，大多數(shù)研究對(duì)象有待進(jìn)一步完善耳聾基因診斷及主觀行為測(cè)聽等相關(guān)檢查來驗(yàn)證其基因型與聽力表型的相關(guān)性;今后還需進(jìn)行持續(xù)的聽力隨訪，以期為臨床咨詢提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。