李宇君,王 楠,楊妙妍,張 琳,薛陽利,鄭 樂,梁俊榮

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,西安 710004;2陜西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室;3空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院消化內(nèi)科;#共同第一作者；*通訊作者,E-mail:liangjunrong2009@163.com)

母代的妊娠期是其宮內(nèi)胎兒腸道發(fā)育的關鍵時期，為胎兒從子宮到外部環(huán)境的過渡做準備[1]。妊娠期間的某些環(huán)境變化如蛋白質(zhì)缺乏，可能會擾亂子代腸道的發(fā)育并對子代的代謝產(chǎn)生長期的影響。由于葡萄糖主要經(jīng)過腸道轉(zhuǎn)運吸收進入機體，因此探討母代的蛋白質(zhì)缺乏對子代腸道糖轉(zhuǎn)運相關受體的影響，對于研究糖代謝受損機制有比較確切的意義和價值。腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運主要由鈉依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(SGLT1)介導，而SGLT1也參與葡萄糖誘導的腸促胰島素的分泌[2]。另外，葡萄糖轉(zhuǎn)運體2和5(GLUT2和GLUT5)在葡萄糖或果糖從腸細胞釋放進入循環(huán)的過程中也發(fā)揮主要介導作用[3]。此外，消化道分泌的多種激素通過多種作用途徑參與調(diào)節(jié)機體糖代謝及脂代謝。胰島素由胰島β細胞分泌，是降低血糖的重要激素，也可以促進蛋白質(zhì)和脂肪合成[4]。胰高糖素樣肽-1(GLP-1)由回腸和結(jié)腸中的L細胞分泌，以葡萄糖依賴的方式刺激胰島素分泌，改善脂質(zhì)代謝，并參與調(diào)節(jié)食欲和攝食行為[5,6]。酪氨酸-酪氨酸多肽(PYY)主要由遠端腸道L細胞分泌，抑制食欲，延緩胃排空，并參與調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪誘導的胰島素分泌[7]。國內(nèi)外研究中，關于母代的蛋白質(zhì)缺乏對子代葡萄糖代謝產(chǎn)生影響的文章較多，但是其機制尚不明確，尤其與腸道轉(zhuǎn)運體相關的研究很少。本實驗中，對大鼠在妊娠和哺乳期間給予低蛋白飼料的干預，在子鼠離乳后給予標準飼料，從子鼠出生后每周測量體質(zhì)量，在子鼠3周齡和10周齡時進行葡萄糖耐量試驗，檢測糖脂代謝相關激素的濃度，并評估子鼠腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達。通過這些實驗，初步探討親代低蛋白飲食對子代葡萄糖代謝、糖脂代謝相關激素及腸道糖轉(zhuǎn)運體的影響，以及在子代離乳后，通過喂食標準飲食后能否逆轉(zhuǎn)這一影響。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)

妊娠第2天的雌性SD清潔級大鼠12只，購自西安交通大學醫(yī)學試驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2018-001。單籠飼養(yǎng)，自由采食飲水。飼養(yǎng)室溫度(23±1)℃，相對濕度55%～60%，12 h亮暗交替。動物試驗獲得西安交通大學動物保護委員會的批準。飼料購自北京科澳協(xié)利飼料有限公司。將12只妊娠大鼠隨機分為標準飼料組(飼喂22.8%蛋白質(zhì)的飼料)和低蛋白飼料組(飼喂12.8%蛋白質(zhì)的飼料)，2種飼料的組分、含量及提供的熱量比例見表1，所有的大鼠妊娠期間均單獨飼喂。將分娩日設為子鼠出生第0天，自子鼠出生后第1天起，每籠只保留4只子代雄鼠，所有母鼠的喂養(yǎng)情況與妊娠期間相同，并使每只子鼠保證相似的奶水供應條件，每周稱子鼠體質(zhì)量。子鼠3周齡離乳之后給所有的子鼠均喂食標準飼料直到10周齡。每周測量1次食物攝取量和子鼠體質(zhì)量。計算體質(zhì)量增加值=(n+1周體質(zhì)量-n周體質(zhì)量)/n周體質(zhì)量。計算相對食物攝取量(=絕對攝食量/體質(zhì)量)。另外，在子鼠第2，3，7，10周，計算體質(zhì)量指數(shù)(=體質(zhì)量/鼻尖到尾根的長度的平方)和生長效率(=體質(zhì)量/食物攝取量)。

表1 大鼠標準飼料和低蛋白飼料的配方Table 1 Composition of standard diet and PR diet for rats

1.2 應用血糖儀和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測葡萄糖耐量及胰島素釋放

在3周齡和10周齡，從每籠子鼠中隨機選取1只，進行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)。子鼠禁食12 h(可飲水)，口服20%葡萄糖(2.0 g/kg)無菌水溶液，口服葡萄糖后0，30，60，120 min測血糖，由羅氏血糖儀通過尾部小劃痕檢測基線血糖。應用大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，產(chǎn)品編號CSB-E05070r)檢測靜脈血清胰島素。

1.3 組織和血液樣本的收集和處理

為了避免糖耐量試驗對子鼠發(fā)育的潛在影響，對另外2只未進行糖耐量試驗的子鼠分別采集3周齡和10周齡的血液和十二指腸、空腸和回腸的組織樣本。子鼠禁食4 h后采集血液，4 ℃低溫離心機2 000g離心15 min，上清(即血清)在-80 ℃保存。處死后取其十二指腸、空腸和回腸縱向分開，用生理鹽水沖洗，-80 ℃保存。

1.4 大鼠代謝性激素磁珠板檢測血漿中激素水平

取出-80 ℃保存的血清，添加DPP4抑制劑后，應用大鼠代謝性激素磁珠板(美國Millipore公司，產(chǎn)品編號RMHMAG-84K)，嚴格按照產(chǎn)品說明書的步驟檢測血清中胰島素、GLP-1和PYY的濃度。

1.5 應用半定量和實時定量PCR的方法檢測目的基因的表達水平

從冷凍小腸組織中切取直徑約為3 mm的組織塊，應用TRIzol法提取RNA：加入TRIzol試劑1 ml和磁珠后，使用電動勻漿器研磨20 min；取出磁珠，靜置5 min；加入氯仿0.2 ml，劇烈振蕩15 s后靜置3 min；4 ℃離心機12 000g離心15 min；將上層水相層移入1.5 ml無RNA酶EP管，加入異丙醇0.5 ml，混勻后室溫下靜置10 min；4 ℃離心機，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心10 min，棄上清；加入1 ml 75%乙醇清洗RNA，轉(zhuǎn)速7 500 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清，吸水紙瀝干；再次于4 ℃離心機，轉(zhuǎn)速7 500 r/min，離心5 min，吸棄管中殘余乙醇并風干RNA沉淀；根據(jù)RNA沉淀的大小加20～80 μl DEPC水，混勻后瞬離，在60 ℃金屬浴溫育15 min；測定RNA濃度。應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit兩步法)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作。半定量PCR試驗反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。4 ℃冷卻保存。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗證。實時熒光定量PCR試驗，應用SYBR?Green Master Mix試劑盒(TaKaRa公司)，并嚴格按照說明書操作，PCR反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，38個循環(huán)，讀板，60 ℃到95 ℃溫度遞增測定溶解曲線。所用引物見表2。

表2 半定量PCR和實時定量PCR試驗的引物序列Table 2 Primer sequences used for RT-PCR and qRT-PCR

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 親代低蛋白飲食對子鼠體質(zhì)量和食物攝入量的影響

與標準組子鼠相比，低蛋白組子鼠在離乳前(3周內(nèi))平均體質(zhì)量降低(P<0.05)，離乳后均給予標準飼料，觀察至10周齡，低蛋白組子鼠平均體質(zhì)量仍較標準組降低(P<0.05，見圖1)。標準組子鼠從第3周開始快速增長，而低蛋白組子鼠的體質(zhì)量增加在前3周均處于較低水平，從第4周開始增長加快，并且體質(zhì)量增加量高于標準組(P<0.05)，直到10周齡降低到與標準組相似的水平(見圖1)。4～10周齡低蛋白組子鼠的絕對食物攝取量(絕對攝食量)低于標準組(P<0.05)，但是相對攝食量高于標準組(見圖1)。在第2，3，7，10周計算子鼠的體質(zhì)量指數(shù)，低蛋白組子鼠體質(zhì)量指數(shù)(BMI)也低于標準組(見圖1)。低蛋白組子鼠在4～10周的生長效率持續(xù)偏低(見圖1)。

與標準組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；樣本每組6籠，3周齡前每籠4只子鼠，3周齡后每籠2只子鼠圖1 標準組和低蛋白組子鼠的體質(zhì)量及攝食量Figure 1 Body weight and food intake of the offspring in standard group and PR group

2.2 親代低蛋白飲食對子鼠口服葡萄糖耐量試驗的影響

在3周齡離乳時行口服糖耐量試驗，兩組子鼠空腹血糖均在5.2 mmol/L左右，在口服葡萄糖30 min時血糖濃度最高，60 min血糖逐漸下降，120 min恢復正常；其中在30，60 min時，低蛋白組子鼠的平均血糖水平低于標準組(P<0.05，見圖2)。檢測兩組的胰島素水平，低蛋白組在60 min時胰島素分泌高于標準組(P<0.05)，120 min時回落到與標準組相似的水平(見圖2)。在10周齡時，兩組均在30 min血糖濃度最高，而低蛋白組的平均血糖水平高于標準組(P<0.01，見圖2)。低蛋白組胰島素水平在0 min時較標準組子鼠低(P<0.01)，其余節(jié)點兩者無明顯差異(見圖2)。10周齡時，低蛋白組子鼠的平均血糖升高，說明其胰島素分泌相對不足導致糖代謝穩(wěn)態(tài)失衡。

與標準組比較，*P<0.05,**P<0.01圖2 標準組和低蛋白組子鼠在3周齡和10周齡的口服葡萄糖耐量試驗 (n=6)Figure 2 Oral glucose tolerance test results of the offspring in standard group and PR group at 3 weeks or 10 weeks of age (n=6)

2.3 親代低蛋白飲食對子鼠血液中糖脂代謝相關激素濃度的影響

在3周齡和10周齡時檢測低蛋白飼料對靜脈血中糖脂代謝相關激素濃度的影響。結(jié)果提示，與標準組相比，3周齡時低蛋白組子鼠血漿GLP-1水平降低(P<0.05)，但是胰島素和PYY沒有明顯差異(見圖3)；與標準組比較，10周齡時低蛋白組子鼠血漿胰島素水平降低(P<0.01)，GLP-1和PYY水平也降低(P<0.05，見圖3)。

與標準組比較，*P<0.05,**P<0.01圖3 標準組和低蛋白組子鼠血液中糖脂代謝相關激素的濃度 (n=6)Figure 3 Concentrations of glucose metabolism-related hormones in blood of offspring in standard group and PR group (n=6)

2.4 子鼠的小腸組織中SGLT-1，GLUT2和GLUT5的mRNA表達

分別應用半定量PCR試驗和實時熒光定量PCR試驗比較低蛋白組與標準組子鼠的小腸組織中SGLT-1、GLUT2和GLUT5這3種基因的mRNA表達水平。結(jié)果表明，與標準組相比，低蛋白組的子鼠3周齡時十二指腸、空腸組織中3種基因的mRNA表達水平均增加，回腸組織中僅GLUT2和GLUT5的mRNA表達增加(P<0.05，見圖4)。在10周齡時，與標準組相比，低蛋白組子代的十二指腸組織中SGLT-1的mRNA表達升高(P<0.05)，而GLUT2和GLUT5的表達無統(tǒng)計學差異(見圖4)；10周齡低蛋白組子代的空腸組織中SGLT-1和GLUT2的表達水平均較標準組升高(P<0.05)，而GLUT5的mRNA的表達無統(tǒng)計學差異；但是10周齡回腸組織中3種基因的mRNA表達水平，兩組間均無統(tǒng)計學差異(見圖4)。

M. 100～1 000 bp DNA分子量標記；與標準組比較，*P<0.05,**P<0.01圖4 標準組和低蛋白組子鼠小腸組織中SGLT-1、GLUT2和GLUT5的mRNA表達 (n=6)Figure 4 The mRNA expression of SGLT-1, GLUT2 and GLUT5 in small intestine tissue of offspring in standard group and PR group (n=6)

3 討論

產(chǎn)婦在圍產(chǎn)期的營養(yǎng)狀況，對后代的代謝造成長期的影響。本研究中建立了圍產(chǎn)期低蛋白飼養(yǎng)大鼠模型，結(jié)果表明母代的低蛋白飲食對后代的早期生長和糖耐量有顯著影響。首先，與標準組相比，母代在妊娠期和哺乳期給予低蛋白飼料，導致子代出生時低體質(zhì)量。在3周齡離乳后給予標準飼料，從4周齡開始至10周齡，其體質(zhì)量增加量及相對食物攝取量高于標準組，出現(xiàn)了追趕性生長。但是其體質(zhì)量、絕對食物攝取量、體質(zhì)量指數(shù)一直低于標準組，說明離乳后提供標準蛋白含量的飲食，也不可能完全糾正其發(fā)育的缺陷。由于4周齡以后的大鼠即為成年鼠，因此得出結(jié)論，母代的低蛋白飲食對子代體質(zhì)量的影響可持續(xù)到成年。其次，母代的低蛋白飲食與子代成年后葡萄糖代謝異常有關。標準組的子代在3周齡和10周齡時，子鼠的糖耐量均在正常范圍。低蛋白組子代3周齡時糖耐量尚在正常范圍，但是在10周齡時，糖耐量試驗中30 min的血糖濃度高于標準組，且胰島素分泌低于標準組，說明胰島素分泌相對不足。這一結(jié)果表明：母代的低蛋白飲食導致子代早期出現(xiàn)胰島素分泌相對不足和糖耐量異常，成為糖尿病的高危人群。

體內(nèi)多種激素參與調(diào)控葡萄糖的代謝，并且與胰島β細胞功能相關。既往研究表明，在哺乳動物的妊娠期給予低蛋白飲食，會導致其子代胰島β細胞功能障礙，使胰島素和胰淀素等的分泌減少[8]，并導致其成年后出現(xiàn)心血管疾病和代謝功能的異常[9]。胰島素由胰島β細胞分泌，是降低血糖的重要激素[4]。GLP-1是腸源性激素，以葡萄糖依賴的方式刺激胰島素分泌，并參與調(diào)節(jié)食欲和攝食行為[5,6]。另外，PYY調(diào)節(jié)胰島素分泌，增加機體對胰島素的敏感性，還可以抑制胃腸蠕動，增加飽腹感[7]。這3種激素均與糖代謝密切相關，因此本研究檢測了血漿中的胰島素、GLP-1和PYY激素濃度。結(jié)果提示，與標準組相比，低蛋白組子鼠3周齡的GLP-1濃度降低，10周齡的胰島素、GLP-1和PYY濃度均降低。說明在低蛋白組的子代，伴隨著糖代謝穩(wěn)態(tài)失衡，胰島細胞功能逐漸下降，糖代謝相關的激素濃度也下降。由于上述激素也參與脂肪代謝，其分泌減少后，脂肪分解增加或生成障礙，脂肪含量減少，這是導致子鼠體質(zhì)量減少的重要原因[10,11]。

母代低蛋白飲食導致子代低出生體質(zhì)量及糖代謝失衡的遺傳學機制尚不明確。有學者認為母體妊娠期的營養(yǎng)變化導致后代代謝性疾病風險增加的機制可能不是基于基因缺陷，而是由于在胎兒發(fā)育過程中為了適應環(huán)境變化，而通過表觀遺傳學等修飾改變了某些基因的表達[12]。比如有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠母代的低蛋白飲食增加了子代腸道中能量代謝基因Pgc1a的mRNA表達，激活了PPARγ信號通路引起代謝異常[13]。據(jù)此推斷母代的低蛋白攝入，使得胎兒營養(yǎng)缺乏，從而導致胎兒的腸道吸收和轉(zhuǎn)運葡萄糖的相關受體發(fā)生了一定的適應性改變。

腸道葡萄糖的吸收主要由鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(SGLT-1)介導，在病態(tài)肥胖的人群中，其SGLT-1基因表達增加，使得近端腸道葡萄糖吸收加快，腸促胰島素分泌增多，導致高血糖和高胰島素血癥[3,14]。另外，腸道葡萄糖的過度吸收還與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2和5(GLUT2和GLUT5)的表達和適應性增加有關[15-17]。因此進一步檢測3周齡和10周齡子鼠的腸道中SGLT-1、GLUT2和GLUT5的mRNA表達。結(jié)果表明，母代低蛋白飲食增加了3周齡子代小腸組織中SGLT-1、GLUT2和GLUT5的mRNA水平，3周齡離乳后的子鼠給予標準飼料至10周齡時，十二指腸及空腸組織中的SGLT-1以及空腸組織中的GLUT2的表達仍高于標準組，而在3種小腸組織中檢測GLUT5的表達與標準組無明顯差異。綜上，腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運體的增加使得子代的腸道對葡萄糖的感受、吸收增強，在相同的飲食條件下，加重了胰島β細胞的負擔，從而增加了糖耐量異常的風險。

綜上，母代在圍產(chǎn)期的低蛋白飲食導致子代腸道中葡萄糖轉(zhuǎn)運相關基因SGLT-1、GLUT2和GLUT5的表達水平增加，使得腸道對葡萄糖的感受和吸收增強，加重了胰島β細胞負擔，影響了胰島β細胞的功能，導致胰島素分泌減少，從而影響了糖代謝穩(wěn)態(tài)，并降低了子代血清中參與糖類代謝的激素(胰島素、GLP-1和PYY)的濃度。由于這些激素也與脂類代謝相關，其分泌減少后，脂肪分解增加或生成障礙，這是導致子鼠出生時和發(fā)育早期的體質(zhì)量減少的重要原因。如果在子代離乳后進食標準蛋白含量的飼料，可能會部分減弱這一影響，但不會完全逆轉(zhuǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)母代圍產(chǎn)期的蛋白質(zhì)缺乏導致小腸內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達上調(diào)，從而對胰島β細胞和糖脂代謝相關激素產(chǎn)生一定影響，這可能是導致子代糖脂代謝紊亂的機制之一，對于肥胖和糖尿病的研究和藥物開發(fā)提供了新思路。