許進(jìn)業(yè)，許鳳清,2，孔垂皓，趙宏蘇,2，王仁中,2*，吳德玲,2*

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2中藥研究與開發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012

粉防己(StephaniatetrandraS.Moore)為防己科千金藤屬植物，主要分布于江西、安徽南部、浙江、福建等地區(qū)[1]。以其干燥的根入藥，具有祛風(fēng)止痛、利水消腫的功效，用于風(fēng)濕痹痛、水腫腳氣、小便不利和濕疹瘡毒。前期研究表明，粉防己主要含有生物堿類成分[2,3]，其生物堿的類型包括雙芐基異喹啉類、原小檗堿類、阿樸菲類、原阿樸菲類和菲類等多種結(jié)構(gòu)類型?，F(xiàn)代藥理研究表明粉防己和粉防己堿在抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗肝纖維化、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗菌、抗高血壓等方面具有顯著生物活性[4-10]。為了進(jìn)一步研究粉防己中的其他活性成分，本研究對粉防己根的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，并探究所得化合物對TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞LX-2增殖的影響，研究結(jié)果將闡明粉防己抗肝纖維的藥效物質(zhì)，同時(shí)也為抗肝纖維化藥物的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-400 NMR核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；SEP LC52半制備高效液相色譜儀(北京賽普瑞思科技有限公司)；API-4500質(zhì)譜儀(美國ABI公司)；SpectraMAX酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；Cell Counting Kit-8檢測試劑盒(Dojindo公司)；TGF-β1(Peprotech公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；C18色譜柱(CAPCELL PAK-MGⅡ，250×10 mm，5 μm)、硅膠填料(100～200目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(50 μm，瑞典Ge公司)；反相材料RP-C18(50 μm，德國Merck公司)；乙腈為色譜級，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

粉防己的根來源于江西省九江市，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所馬林教授鑒定為防己科千金藤屬植物粉防己StephaniatetrandraS.Moore的干燥根。人肝星狀細(xì)胞(LX-2)由安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取與分離

粉防己的根98.0 kg，經(jīng)粉碎處理，用95%乙醇回流提取三次，提取液在減壓條件下，濃縮得到8.0 kg粗提物。利用1% HCl稀酸溶液充分溶解粗提物，并用濃氨水調(diào)節(jié)溶液的pH至2～3，過濾，濾液再用濃氨水調(diào)節(jié)pH至9～10，依次用氯仿、乙酸乙酯各萃取三次，減壓回收溶劑，得到氯仿部位(2.1 kg)和乙酸乙酯部位(36.0 g)。

氯仿部位(2.1 kg)利用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，流動(dòng)相采用石油醚-丙酮體系(1∶0→25∶1)和三氯甲烷-甲醇體系(30∶1→0∶1)進(jìn)行梯度洗脫，通過TLC檢識(shí)、合并，共得到7個(gè)洗脫流份Fr.C1～Fr.C7。Fr.C5(36.0 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，利用二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，得到四個(gè)流分Fr.C5.1～ Fr.C5.4。Fr.C5.4(12.6 g)經(jīng)ODS柱色譜，利用乙腈-0.01%氨水(5∶95→1∶0)進(jìn)行梯度洗脫，得到Fr.C5.4.1～Fr.C5.4.5。Fr.C5.4.1(50.5 mg)應(yīng)用半制備HPLC進(jìn)行純化，乙腈-0.01%氨水(10∶90)為流動(dòng)相，得到化合物1(5.7 mg)。 Fr.C5.4.2(67.5 mg)用半制備HPLC進(jìn)行純化，乙腈-0.01%氨水(8∶92)為流動(dòng)相，得到化合物2(6.1 mg)。Fr.C5.4.2(35.9 mg)通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以甲醇為洗脫劑進(jìn)行分離，得到化合物3(5.6 mg)和4(5.5 mg)。Fr.C5.4.3(108.9 mg)通過半制備HPLC純化，以乙腈-0.01%氨水(27∶73)為流動(dòng)相，得到化合物5(8.0 mg)。Fr.C5.4.4(23.9 mg)通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以甲醇為洗脫劑進(jìn)行分離，再利用半制備HPLC進(jìn)行純化，以乙腈-0.01%氨水(31∶69)為流動(dòng)相，得到化合物6(5.4 mg)。Fr.C5.4.5(34.5 mg)通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以甲醇為洗脫劑進(jìn)行分離，再利用半制備HPLC進(jìn)一步純化，乙腈-0.01%氨水(14∶86)為流動(dòng)相，得到化合物7(4.7 mg)。Fr.C5.4.4析出晶體，得到化合物8(8.0 mg)。

乙酸乙酯部位(36.0 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，流動(dòng)相采用石油醚-丙酮體系(1∶0→25∶1)，三氯甲烷-甲醇體系(30∶1→0∶1)進(jìn)行梯度洗脫，通過TLC檢識(shí)、合并，共得到5個(gè)流分Fr.EA1～ Fr.EA5。流分Fr.EA1(12.0 g)通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜，利用二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，得到4個(gè)流份Fr.EA1.1～ Fr.EA1.4。Fr.EA1.1(700.0 mg)經(jīng)ODS柱色譜，乙腈-0.1%甲酸水(5∶95→1∶0)梯度洗脫得Fr.EA1.1.1～Fr.EA1.1.4。Fr.EA1.1.1(17.3 mg)再利用半制備HPLC進(jìn)一步純化，乙腈-0.1%甲酸水(16∶84)為流動(dòng)相，得到化合物9(8.0 mg)。Fr.EA1.1.2(35.6 mg)通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以甲醇為洗脫劑進(jìn)行分離，得到化合物10(9.0 mg)。Fr.EA1.1.3(50.9 mg)經(jīng) ODS柱色譜，乙腈-0.1%甲酸水(5∶95→100∶0)梯度洗脫，再利用半制備HPLC進(jìn)一步純化，乙腈-0.1%甲酸水(12∶88)為流動(dòng)相得到化合物11(10.0 mg)和12(9.0 mg)。Fr.EA1.1.4(77.8 mg)利用半制備HPLC進(jìn)一步純化，乙腈-0.1%甲酸水(25∶75)為流動(dòng)相，得到化合物13(20.0 mg)。

1.3.2 活性評價(jià)

LX-2細(xì)胞株用含10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以5×104/mL細(xì)胞密度均勻接種至96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。將實(shí)驗(yàn)分為三組：(A)空白組、(B)正常對照組、(C)TGF-β1+待測化合物(10 μmol/L)組，C組用TGF-β1(10 ng/mL)預(yù)處理，B組同時(shí)用PBS相同劑量處理。隨后C組加入待測化合物(化合物用DMSO溶解，測試濃度為10 μmol/L)，B組同時(shí)加入相同劑量DMSO，每組3個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5% CO2，恒溫培養(yǎng)48 h。向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃，5% CO2培養(yǎng)40 min。用酶標(biāo)儀測定其在450 nm處的OD值并按如下公式計(jì)算被測化合物對LX-2細(xì)胞的抑制率。

抑制率=

[(OD對照-OD試驗(yàn))/(OD對照-OD空白)]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色針狀結(jié)晶(甲醇)；改良碘化鉍鉀顯色劑呈磚紅色，提示其為生物堿類化合物；ESI-MS：m/z342.0 [M]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.96(1H，d，J= 8.4 Hz，H-11)，6.87(1H，s，H-4)，6.72(1H，s，H-1)，6.70(1H，d，J= 7.8 Hz，H-12)，4.82(1H，d，J= 16.1 Hz，H-8)，4.71(1H，dd，J= 9.9，5.9 Hz，H-13a)，4.64(1H，J= 16.1 Hz，H-8)，3.87(3H，s，3-OCH3)，3.85(3H，s，10-OCH3)，3.82(1H，m，H-6)，3.59(1H，m，H-6)，3.41(1H，dd，J= 18.5，5.7 Hz，H-13)，3.15(1H，dd，J= 18.4，10.0 Hz，H-13)，2.27(3H，s，NCH3)，2.25(2H，m，H-5)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：114.3(C-1)，147.3(C-2)，149.9(C-3)，113.1(C-4，11)，24.1(C-5)，53.8(C-6)，60.8(C-8)，144.5(C-9)，147.5(C-10)，119.8(C-12)，34.6(C-13)，120.4(C-4a)，114.3(C-8a)，123.0(C-12a)，67.1(C-13a)，125.4(C-13b)，56.7(3-OCH3)，56.5(10-OCH3)，50.9(NCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定為cyclanoline。

化合物2白色無定形粉末(甲醇)；改良碘化鉍鉀顯色劑呈磚紅色，提示其為生物堿類化合物；ESI-MS：m/z308.1 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.06(2H，d，J= 8.2 Hz，H-2′，H-6′)，6.74(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3′，H-5′)，6.68(1H，s，H-5)，6.63(1H，s，H-8)，4.00(1H，dd，J= 9.4，4.0 Hz，H-1)，3.82(3H，s，6-OCH3)，3.17(1H，m，H-3a)，3.10(1H，m，H-3b)，2.83(1H，m，H-α)，2.78(1H，m，H-α)，2.74(1H，m，H-4a)，2.70(1H，m，H-4b)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：58.0(C-1)，42.2(C-3)，29.6(C-4)，116.5(C-5)，147.8(C-6)，145.7(C-7)，113.0(C-8)，131.4(C-1′)，131.3(C-2′，6′)，114.1(C-3′，5′)，157.2(C-4′)，126.9(C-4a)，130.5(C-8a)，56.4(6-OCH3)，41.4(C-α)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定為coclaurine。

化合物3白色無定形粉末(甲醇)；改良碘化鉍鉀顯色劑呈磚紅色，提示其為生物堿類化合物；ESI-MS：m/z246.0 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：9.45(1H，s，CHO)，7.01(1H，d，J= 4.0 Hz ，H-3)，6.91(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2″，H-6″)，6.66(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3″，H-5″)，6.20(1H，J= 4.0 Hz，H-4)，4.48(2H，t，J= 7.2 Hz，H-1′)，4.27(2H，s，H-6)，2.91(2H，t，J= 7.3 Hz，H-2′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：133.3(C-2)，126.4(C-3)，111.2(C-4)，144.9(C-5)，56.4(C-6)，49.6(C-1′)，37.8(C-2′)，131.0(C-1″)，130.6(C-2″，C-6″)，116.3(C-3″，C-5″)，157.2(C-4″)，180.9(-CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定為5-hydroxymethyl-1-[2-(4- hydroxyphenyl)-ethyl]-1H-pyrrole-2-carbaldehyde。

化合物4白色無定形粉末(甲醇)；改良碘化鉍鉀顯色劑呈磚紅色，提示其為生物堿類化合物；ESI-MS：m/z194.0 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.62(1H，s，H-8)，6.61(1H，s，H-5)，3.98(1H，q，J= 6.8 Hz，H-1)，3.80(3H，s，6-OCH3)，3.21(1H，m，H-3a)，2.94(1H，m，H-3b)，2.83(1H，m，H-4a)，2.68(1H，m，H-4b)，1.41(3H，d，J= 6.8 Hz，1-CH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：52.1(C-1)，42.4(C-3)，29.1(C-4)，113.0(C-5)，147.8(C-6)，146.0(C-7)，113.6(C-8)，126.1(C-4a)，132.4(C-8a)，22.0(1-OCH3)，56.4(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定為isosalsoline。

化合物5白色無定形粉末(甲醇)；改良碘化鉍鉀顯色劑呈磚紅色，提示其為生物堿類化合物；ESI-MS：m/z208.0 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.36(1H，s，H-8)，6.80(1H，s，H-5)，3.90(3H，s，6-OCH3)，3.59(2H，t，J= 6.8 Hz，H-3)，3.10(3H，s，NCH3)，2.93(2H，t，J= 6.7 Hz，H-4)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：167.2(C-1)，49.6(C-3)，28.2(C-4)，110.8(C-5)，152.5(C-6)，146.5(C-7)，115.1(C-8)，132.7(C-4a)，122.7(C-8a)，56.5(6-OCH3)，35.5(NCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定為thalifoline。

化合物6白色無定形粉末(甲醇)；改良碘化鉍鉀顯色劑呈磚紅色，提示其為生物堿類化合物；ESI-MS：m/z194.1 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.35(1H，s，H-8)，6.83(1H，s，H-5)，3.90(3H，s，6-OCH3)，3.46(2H，t，J= 4.0 Hz，H-3)，2.93(2H，t，J= 8.0 Hz，H-4)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.7(C-1)，41.2(C-3)，28.6(C-4)，111.1(C-5)，152.8(C-6)，146.6(C-7)，114.8(C-8)，133.6(C-4a)，122.4(C-8a)，56.5(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定為northalifoline。

化合物7白色無定形粉末(甲醇)；改良碘化鉍鉀顯色劑呈磚紅色，其為生物堿類化合物；ESI-MS：m/z108.0 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.81(1H，dd，J= 3.2，1.0 Hz，H-6)，7.12(1H，dd，J= 5.4，1.0 Hz，H-4)，7.06(1H，dd，J= 5.4，3.2 Hz，H-5)，2.39(3H，s，2-CH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：147.9(C-2)，154.6(C-3)，123.4(C-4)，123.6(C-5)，138.9(C-6)，18.5(2-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定為2-甲基-3-羥基吡啶。

化合物8白色無定形粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z419.0 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.59(1H，s，H-5)，6.38(2H，s，H-2′和H-6′)，4.31(1H，d，J= 5.5 Hz，H-1)，3.86(3H，s，8-OCH3)，3.74(6H，s，3′，5′-OCH3)，3.51(2H，m，H-3a)，3.50(2H，m，H-2a)，3.38(3H，s，6-OCH3)，2.70(1H，m，H-4)，1.97(1H，m，H-2)，1.63(1H，m，H-3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：42.3(C-1)，48.5(C-2)，40.9(C-3)，33.6(C-4)，107.8(C-5)，147.7(C-6)，139.3(C-7)，148.7(C-8)，126.2(C-9)，130.2(C-10)，138.9(C-1′)，106.9(C-2′，C-6′)，149.0(C-3′，5′)，134.5(C-4′)，66.8(C-3a)，64.2(C-2a)，56.6(6-OCH3)，60.2(8-OCH3)，56.8(3′，5′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定為(+)-lyoniresinol。

化合物9白色無定形粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z389.2 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：5.82(1H，s，H-4)，4.32(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′)，3.85(1H，dd，J= 11.2，2.0 Hz，Hb-6′)，3.66(1H，dd，J= 11.8，4.9 Hz，Ha-6′)，3.34(1H，m，H-5′)，3.27(1H，t，J= 9.8 Hz，H-4′)，3.25(1H，t，J= 12.0 Hz，H-3′)，3.14(1H，t，J= 8.2 Hz，H-2′)，2.66(1H，J= 17.9 Hz，Ha-2)，2.14(1H，d，J= 18.3 Hz，Hb-2)，2.09(1H，m，Hb-7)，2.04(3H，s，H-13)，1.85(1H，m，Ha-7)，1.78(1H，m，Hb-8)，1.50(1H，m，Ha-8)，1.25(3H，s，H-10)，1.10(3H，s，H-12)，1.02(3H，s，H-11)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：43.1(C-1)，51.1(C-2)，201.0(C-3)，126.7(C-4)，171.8(C-5)，79.4(C-6)，34.7(C-7)，33.0(C-8)，78.3(C-9)，22.1(C-10)，24.4(C-11)，24.0(C-12)，22.0(C-13)，104.3(C-1′)，75.3(C-2′)，77.9(C-3′)，71.7(C-4′)，78.4(C-5′)，62.8(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定為icariside B5。

化合物10無色晶體(甲醇)；ESI-MS：m/z196.8 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.36(2H，s，H-2，6)，3.89(6H，s，3，5-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：121.1(C-1)，108.4(C-2，6)，148.9(C-3，C-5)，142.1(C-4)，56.9(3，5-OCH3)167.9(-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定為丁香酸。

化合物11無色針狀結(jié)晶(甲醇)；ESI-MS：m/z174.8 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.09(2H，J= 8.4 Hz，H-2，6)，6.73(2H，d，J= 8.5 Hz，H-3，5)，3.49(2H，s，H-7)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：126.8(C-1)，131.4(C-2)，116.2(C-3)，157.4(C-4)，116.2(C-5)，131.3(C-6)，41.1(C-7)176.2(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定為對羥基苯乙酸。

化合物12無色針狀結(jié)晶(甲醇)；ESI-MS：m/z138.2 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.88(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2，6)，6.82(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3，5)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：122.8(C-1)，133.0(C-2，6)，116.0(C-3，5)，163.4(C-4)，170.1(-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，故鑒定為對羥基苯甲酸。

化合物13淺黃色粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z165.2 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.07(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6)，6.72(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5)，3.66(3H，s，8-OCH3)，3.52(2H，s，H-7)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：126.3(C-1)，131.3(C-2，6)，116.3(C-3，5)，157.6(C-4)，40.9(C-7)，174.6(C-8)，52.4(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致，故鑒定為對羥基苯乙酸甲酯。

化合物1～13的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-13

2.2 化合物對LX-2細(xì)胞的抑制活性

檢測了化合物1～13對LX-2細(xì)胞的抑制活性。在濃度為10 μmol/L時(shí)，化合物2、5、6、10～12對TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用，其抑制率分別為(90.72 ± 5.13)%、(49.14 ± 9.57)%、(90.23 ± 3.99)%、(75.81 ±7.19)%、(54.36 ± 10.84)%和(54.74 ± 11.87)%，其中化合物2的抑制作用最強(qiáng)。其余化合物對TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖無抑制作用(見圖2)。

圖2 化合物濃度在10 μmol/L時(shí)對LX-2細(xì)胞增殖的抑制活性(n = 3)Fig.2 The inhibitory activities of compounds on LX-2 cells at the concentration of 10 μmol/L ( n = 3)

3 結(jié)論

本研究從粉防己中分離鑒定得到13個(gè)化合物，其中有7個(gè)生物堿類成分，結(jié)構(gòu)類型分別為原小檗堿類(1)、芐基異喹啉類(2)、異喹啉類(4～6)、吡咯類(3)和吡啶類(7)。化合物1～13均為首次從該植物中分離得到，在千金藤屬植物中化合物3、4、6～9未見報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)粉防己中的成分具有顯著地抗肝纖維化[6]作用，針對分離得到的化合物進(jìn)行了抗肝纖維化活性評價(jià)。通過檢測化合物對TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖的影響，初步判斷了化合物的抗肝纖維化活性，結(jié)果表明有6個(gè)化合物(2、5、6、10～12)對LX-2細(xì)胞增殖有顯著抑制作用。本研究結(jié)果將進(jìn)一步闡明了粉防己抗肝纖維化的藥效物質(zhì)，同時(shí)也為抗肝纖維化的先導(dǎo)化合物篩選提供參考。