劉娟娟，張靖柯，曾夢楠，李 孟，朱登輝，魏俊俊，鄭曉珂，馮衛(wèi)生*

1河南中醫(yī)藥大學藥學院；2河南省中藥開發(fā)工程技術研究中心，鄭州 450046

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一類破壞性、不可逆損傷的彌漫性肺間質疾病[1]。其中嚴重呼吸綜合征冠狀病毒和新型冠狀病毒(COVID-19)感染以及多種炎癥性肺部疾病，均可引起肺纖維化[2]。治療上西醫(yī)多采用糖皮質激素、免疫抑制劑、細胞因子抑制劑等進行治療，但不良反應比較多[3]。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，以及中醫(yī)藥在抗擊新冠疫情方面發(fā)揮的核心作用[4]。越來越多的實驗研究表明中藥及其提取物對肺纖維化有良好的治療作用[5]。查閱地方書籍發(fā)現(xiàn)月見草能夠治療肺部相關的疾病。比如《泉州本草》記載用月見草可以治療肺病、瘰疬等。

月見草OenotherabiennisL.為柳葉菜科(Onagraceae)月見草屬(OenotheraL.)多年生草本植物[6]，因在傍晚7～9時開花，故稱為月見草。它是一種集油用、觀賞、藥用于一身的多功能植物[7]，為民間常用的中草藥，全株皆可入藥，該植物主要分布在我國的東北南部及東部山區(qū)等地[8]。月見草種子油中富含γ-亞麻油酸等多種不飽和脂肪酸是人體不可缺少的必需脂肪酸，有很強的生物活性[9-12]。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，目前有關月見草化學成分研究的報道比較少，且缺乏對月見草化學成分的系統(tǒng)研究。為了明確月見草的化學成分，為月見草的后續(xù)開發(fā)利用奠定基礎，本文對月見草全草化學成分進行分離鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

賽譜銳思LC-52型高壓制備液相色譜儀(賽譜銳思北京科技有限公司，SP-5030型半制備型高壓輸液泵，UV200型紫外檢測器，Easychrom型色譜工作站)；OSB-21000型旋轉蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；Bruker AVANCE III 500型核磁共振儀(德國Bruker公司)；Bruker maxis HD型飛行時間質譜(德國Bruker公司)；Thermo Nicolet IS10 紅外光譜儀(Thermo Scientific，USA)；Thermo EVO300紫外分光光度計(Thermo Scientific，USA)；Rudolph AP-IV 型旋光儀(Rudolph，USA)；Multiskan MK3酶標儀(Thermo Fisher,USA)。

硅膠H(200～300目)(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech)；MCI GEL CHP-20(Mitusishi Chemical Corporation)；色譜柱COSMOSIL C18-MS-II，250 mm × 20 mm，5 μm)；薄層色譜硅膠G和GF254(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；色譜甲醇、分析甲醇、分析二氯甲醇、分析乙酸乙酯、分析石油醚、分析正丁醇(天津市富宇精細化工有限公司)，色譜乙腈(美國天地有限公司)。

月見草樣品于2019年8月采自于河南省伏牛山區(qū)，經河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定為柳葉菜科月見草屬植物月見草(OenotherabiennisL.)的干燥全草；留樣標本(YJC-201908)存放于河南中醫(yī)藥大學藥學院河南省中藥開發(fā)工程技術研究中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取與分離

取干燥月見草全草(40 kg)，用50%含水丙酮組織破碎提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮，得到總浸膏(3.3 kg)?？偨嗉拥攘克稚?，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及水飽和正丁醇進行萃取，各部位經減壓濃縮，回收溶劑，得到石油醚部位(5.0 g)、二氯甲烷部位(49.6 g)、乙酸乙酯部位(161.0 g)及正丁醇部位(457.0 g)。二氯甲烷部位進行硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(10∶0 → 0∶1)以及乙酸乙酯-甲醇(5∶1 → 0∶1)洗脫，洗脫組分經TLC檢測，合并相同部分，得到10個組分，即Fr.1～Fr.10。其中Fr.8(2.47 g)洗脫組分進行硅膠柱色譜分離以石油醚-丙酮(20∶1 → 0∶1)梯度洗脫，經TLC檢識，合并相同組分，得到9個組分，即Fr.8-1～Fr.8-9。其中Fr.8-8(0.95 g)進行硅膠柱色譜分離以石油醚-丙酮(15∶1 → 0∶1)梯度洗脫，經TLC檢識，合并相同組分，得到7個組分，即Fr.8-8-1～Fr.8-8-7。其中Fr.8-8-6(0.53 g)加甲醇溶解，進行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷：甲醇(50∶1 → 10∶1)梯度洗脫，得到7個洗脫組分Fr.8-8-6-1～Fr.8-8-6-7。其中Fr.8-8-6-3(0.14 g)進行制備薄層分離純化并結合使用半制備高效液相(乙腈-水洗脫體系)，最終得到化合物9(22.96 mg)。Fr.8-8-6-4(0.27 g)加甲醇溶解，進行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷∶甲醇(50∶1→10∶1)梯度洗脫，得到4個洗脫組分Fr.8-8-6-4-1～Fr.8-8-6-4-4。其中Fr.8-8-6-4-2經Sephadex LH-20凝膠柱色譜(70%甲醇)分離并結合半制備高效液相(甲醇-水洗脫體系)，最終得到化合物3(3.68 mg)、4(1.98 mg)、5(2.55 mg)。Fr.8-8-6-6(0.09 g)經Sephadex LH-20凝膠柱色譜(70%甲醇)分離并結合半制備高效液相(甲醇-水洗脫體系)，最終得到化合物6(1.32 mg)。

乙酸乙酯部位進行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(100∶1 → 0∶1)梯度洗脫，洗脫組分經TLC檢測，合并相同部分，得到5個組分，即Fr.11～Fr.15。其中Fr.13(10.3 g)進行MCI gel CHP-20柱色譜分離，以甲醇-水(0∶100 → 100∶0)梯度洗脫，洗脫組分經TLC檢測，合并相同部分，得到7個組分，即Fr.13-1～Fr.13-7。其中Fr.13-5(1.49 g)加甲醇溶解，進行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷∶甲醇(50∶1 → 10∶1)梯度洗脫，得到4個洗脫組分，即Fr.13-5-1～Fr.13-5-4。Fr.13-5-2(0.21 g)經Sephadex LH-20凝膠柱色譜(70%甲醇)分離并結合半制備高效液相(乙腈-水洗脫體系)，最終得到化合物8(2.70 mg)、10(4.33 mg)。Fr.13-5-3(0.12 g)經Sephadex LH-20凝膠柱色譜(70%甲醇)分離并結合半制備高效液相(乙腈-水洗脫體系)，最終得到化合物7(1.62 mg)。其中Fr.14(28.9 g)進行MCI gel CHP-20柱色譜分離，以甲醇∶水(0∶100 → 100∶0)梯度洗脫，洗脫組分經TLC檢測，合并相同部分，得到9個組分，即Fr.14-1～Fr.14-9。其中Fr.14-2(3.59 g)加甲醇溶解，進行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(30∶1 → 0∶1)梯度洗脫，得到6個洗脫組分Fr.14-2-1～Fr.14-2-6。其中Fr.14-2-4(1.39 g)反復經過硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，并結合使用半制備高效液相(乙腈-水洗脫體系)，最終得到化合物1(6.28 mg)、2(8.76 mg)。

1.2.2 MTT法測定細胞活力

前期課題組成員對月見草總提物以及各分部位進行抗肺纖維化活性實驗研究。為探究其發(fā)揮肺纖維化的活性成分，本研究采用MTT法測定化合物1～10對TGF-β1誘導BEAS-2B細胞損傷的影響，以初步探究其抗肺纖維化的活性成分。

將BEAS-2B細胞置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照細胞密度每毫升2.5×104個細胞，每孔200 μL接種于96孔板中，24 h后分為正常組、模型組(TGF-β1，1 ng/mL)及各給藥組(10 μmol/L + TGF-β1，1 ng/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸取摒棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL的DMSO，在490 nm下測定每個孔吸光度(A)，計算細胞活力(細胞活力=實驗組的OD值/正常組的OD值)。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

1H-1H COSY譜(見圖1)中顯示H-3(δH4.11)和H-2(δH6.87)、H-4(δH3.70)與H-5(δH4.00)和H-4(δH3.70)、H-6(δH2.44，2.53)具有相關，推測該結構中有一個-C=CH-CH-CH-CH-CH2-的結構；在HMBC譜(見圖1)中H-6(δH2.44，2.53)與C-5(δC69.5)、C-4(δC73.8)、C-1(δC130.2)、C-2(δC137.7)、C-7(δC168.5)具有遠程相關，可以確定該結構中有一個莽草酸甲酯結構。1H-1H COSY譜中顯示H-8(δH4.46)和H-10(δH1.40)具有相關；在HMBC譜中δH4.46(H-8)與δC175.8(C-9)、δC78.7(C-3)、δC19.2(C-10)具有遠程相關，推測該結構中有一個-O-CHCH3COOCH3結構，且連在莽草酸甲酯的3位碳原子上。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，結合文獻[13]，由此可以確定該化合物的平面結構。在NOESY譜中，H-4與H-5具有相關信號，說明其位于同側，為β-構型；H-3與H-4無相關信號，說明其位于異側，為α-構型；H-8與H-3具有相關信號，說明其位于同側，為α-構型。經過ECD計算(見圖2)，確定該化合物的絕對構型為3R，4R，5R，8S。經文獻檢索，確定該化合物為新化合物，命名為dimethyl 3-lactyl shikimate(結構見圖3)。該化合物的碳氫數(shù)據(jù)歸屬見表1?；衔?的詳細結構鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1的1H-1H COSY、HMBC相關Fig.1 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR(500 MHz)和13C NMR(125 MHz)數(shù)據(jù)(CD3OD)Table 1 1H NMR (500 MHz) and13C NMR (125 MHz) data for compound 1 (in CD3OD)

圖2 化合物1的實測和計算ECD譜圖Fig.2 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

化合物2無色結晶；分子式為C8H12O5，ESI-MS：m/z211 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.76(1H，m，H-2)，4.29(1H，m，H-3)，4.04(1H，dt，J= 4.8，7.2 Hz，H-5)，3.74(3H，s，7-OCH3)，3.62(1H，d，J= 6.4 Hz，H-4)，2.55(1H，m，H-6a)，2.46(1H，m，H-6b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：129.8(C-1)，139.3(C-2)，70.3(C-3)，75.0(C-4)，69.0(C-5)，32.0(C-6)，168.7(C-7)，52.4(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物2為methyl shikimate。

化合物3黃色固體；分子式為C17H12O8，ESI-MS：m/z367 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.64(1H，s，H-5)，7.54(1H，s，H-5′)，4.06(3H，s，3-OCH3)，4.04(3H，s，4-OCH3)，4.00(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：111.2(C-1)，140.2(C-2)，140.9(C-3)，152.7(C-4)，111.7(C-5)，112.0(C-6)，158.3(C-7)，112.6(C-1′)，141.5(C-2′)，141.0(C-3′)，153.8(C-4′)，107.5(C-5′)，113.4(C-6′)，158.5(C-7′)，61.3(3′-OCH3)，60.9(3-OCH3)，56.7(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物3為3,3′,4-O-三甲基鞣花酸。

化合物4黃色固體;分子式為C16H10O8，ESI-MS：m/z353 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.54(2H，s，H-5，5′)，4.04(6H，s，3，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：111.7(C-1，1′)，141.2(C-2 2′)，140.2(C-3 3′)，152.2(C-4 4′)，111.5(C-5 5′)，112.2(C-6 6′)，158.5(C-7，7′)，61.0(3，3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物4為3,3′-二甲氧基-鞣花酸。

化合物5黃色固體;分子式為C17H12O9，ESI-MS：m/z383 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δH7.54(1H，s，H-5′)，4.15(3H，s，3-OCH3)，4.04(3H，s，4-OCH3)，3.89(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：111.7(C-1)，140.1(C-2)，151.7(C-3)，133.4(C-4)，147.0(C-5)，97.5(C-6)，160.9(C-7)，113.0(C-1′)，141.4(C-2′)，140.6(C-3′)，153.1(C-4′)，111.3(C-5′)，113.4(C-6′)，158.3(C-7′)，61.7(4-OCH3)，61.2(3-OCH3)，61.0(3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物5為3,4,3′-三甲氧基鞣花酸。

化合物6白色晶體;分子式為C15H12O5，ESI-MS：m/z295 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：11.83(1H，s，7-OH)，10.38(1H，s，3-OH)，7.24(1H，d，J= 2.1 Hz，H-10)，6.66(2H，d，J= 2.6 Hz，H-2，4)，6.63(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，3.92(3H，s，9-OCH3)，2.74(1H，s，H-11)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：138.4(C-1)，117.6(C-2)，158.6(C-3)，101.6(C-4)，152.6(C-4a)，166.2(C-6)，98.5(C-6a)，164.1(C-7)，99.2(C-8)，164.7(C-9)，103.4(C-10)，137.8(C-10a)，108.8(C-10b)，25.0(C-11)，55.8(9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，故鑒定化合物6為Alternariol 9-methyl ether。

化合物7淡黃色粉末;分子式為C11H14O6，ESI-MS：m/z242 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.35(2H，s，H-2，6)，5.13(1H，t，J= 3.8 Hz，H-8)，3.80(6H，s，3，5-OCH3)，3.68(1H，dd，J= 11.6，5.1 Hz，H-9a)，3.58(1H，dd，J= 11.6，5.1 Hz，H-9b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：125.3(C-1)，106.3(C-2，6)，147.7(C-3，5)，141.6(C-4)，198.3(C-7)，74.2(C-8)，64.8(C-9)，55.5(3，5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物7為2,3-二羥基-1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙酮。

化合物8白色無定形粉末;分子式為C10H12O5，ESI-MS：m/z235 [M+Na]+，1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：5.95(1H，d，J= 2.2 Hz，H-5)，5.42(1H，d，J= 2.3 Hz，H-3)，3.85(3H，s，4-OCH3)，3.64(3H，s，H-4′)，2.77(2H，m，H-1′)，2.68(2H，m，H-2′)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：164.7(C-2)，88.1(C-3)，171.9(C-4)，99.4(C-5)，164.0(C-6)，29.4(C-1′)，31.1(C-2′)，172.7(C-3′)，51.9(C-4′)，55.6(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致，故鑒定化合物8為scirpyrone H。

化合物9白色無定形粉末;分子式為C12H14O4，ESI-MS：m/z245 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.87(1H，s，H-6)，5.48(1H，dd，J= 6.7，13.2 Hz，H-8)，3.96(3H，s，H-9)，3.94(3H，s，H-11)，2.11(3H，s，H-10)，1.58(3H，d，J= 6.7Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：170.6(C-1)，110.2(C-2)，158.6(C-3)，121.3(C-4)，166.1(C-5)，100.0(C-6)，155.1(C-7)，78.5(C-8)，62.5(C-9)，8.7(C-10)，56.9(C-11)，20.8(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致，故鑒定化合物9為dimethoxydimethylphthalide。

化合物10無定形固體;分子式為C13H14O4，ESI-MS：m/z257 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.47(1H，s，H-4)，4.74(1H，s，H-10a)，4.72(1H，s，H-10b)，4.08(1H，q，J= 7.1 Hz，H-8)，3.93(3H，s，H-13)，2.10(3H，s，H-12)，1.36(3H，d，J= 7.1 Hz，H-11)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：165.9(C-1)，99.2(C-2)，164.0(C-3)，98.3(C-4)，167.6(C-5)，114.8(C-6)，143.3(C-7)，35.3(C-8)，158.3(C-9)，96.0(C-10)，22.5(C-11)，10.1(C-12)，56.5(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道基本一致，故鑒定化合物10為clearanol C。

化合物1～10的結構見圖3。

圖3 化合物1～10的結構Fig.3 Chemical structures of compounds 1-10

2.2 活性測試結果

采用TGF-β1誘導BEAS-2B細胞建立肺纖維化體外模型，探究從月見草中分離得到的化合物1～10對TGF-β1誘導BEAS-2B細胞損傷的影響，結果表明，化合物2、3可顯著提高TGF-β1誘導BEAS-2B細胞的活力，推測其可能具有潛在的肺保護作用。

3 結論

本文通過多種色譜分離技術對月見草的化學成分進行分離純化，得到10個化合物(1～10)，其中化合物1為新化合物；采用MTT法測定了化合物1～10對TGF-β1誘導BEAS-2B細胞損傷的影響，結果顯示化合物2、3可顯著提高TGF-β1誘導BEAS-2B細胞的活力。本文進一步豐富了月見草化學成分，前期研究多集中在月見草油的相關藥理活性[23]，本研究的活性測試結果也拓展了月見草的藥用價值，為月見草的開發(fā)利用積累了基礎數(shù)據(jù)。同時課題組前期對月見草的總提物進行了抗肺纖維化活性篩選研究，為明確其藥效物質基礎，本研究對其化學成分進行分離純化，為其進一步的開發(fā)利用奠定基礎。