劉明靚，陳葉梓，張 磊，劉朝奇，周永芹，袁成福，何毓敏*

1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)發(fā)生發(fā)展的一個(gè)階段的病理變化，其特征為肝臟脂質(zhì)代謝紊亂介導(dǎo)的炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER)、線粒體功能障礙和纖維化，被認(rèn)為是臨床病變發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與肝硬化及肝癌的發(fā)展密切有關(guān)[1]。在NASH進(jìn)展中機(jī)體的“腸-肝軸”調(diào)節(jié)功能紊亂介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有重要作用[2,3]。腸道屏障受損導(dǎo)致代謝性內(nèi)毒素通過(guò)“腸-肝軸”轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，引起肝臟炎癥反應(yīng)。其中，miRNA在肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[4]。非編碼微小RNA(microRNA，miRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，但可通過(guò)靶向目的基因mRNA的3′UTR，抑制基因的表達(dá)。miRNA幾乎參與所有生理病理過(guò)程，miRNA可以通過(guò)靶向炎癥相關(guān)基因，如miR-106低表達(dá)而活化MAPK信號(hào)通路，介導(dǎo)妊娠期高血壓小鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷和炎性浸潤(rùn)[5]。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)miR-106a對(duì)Th17轉(zhuǎn)錄因子Ror和活化T細(xì)胞(Nfat)核因子5的靶位特異性調(diào)節(jié)[6]。這些結(jié)果提示miR-106的低表達(dá)可介導(dǎo)相關(guān)的炎性因子表達(dá)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

地錦草(EuphorbiahumifusaWilld.)系大戟科大戟屬植物。常用于治療細(xì)菌性痢疾、腸胃炎、咳血、便血等病癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，地錦草中含有多種有效成分，如多酚類、黃酮類、生物堿和三萜類化合物等具有抗炎[7]、抗氧化、降血脂、降血糖和降壓、抑菌等多種作用[8-10]。因此本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物水平使用短期高脂飲食(high fat diet，HFD)聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfate sodium，DSS)喂養(yǎng)建立NASH小鼠動(dòng)物模型(HFD+DSS)，DSS是一種可對(duì)小鼠腸道屏障造成損傷，常用于誘導(dǎo)結(jié)腸炎動(dòng)物模型[11]，在此模型上研究地錦草提取物干預(yù)NASH及其可能機(jī)制，為防治NASH提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

40只SPF級(jí)6～8周齡健康的C57BL/6小鼠(雌、雄小鼠各半，體重18～20 g)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)((SCXK)(鄂)2017-0012)，購(gòu)自于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在恒溫(20±2) ℃以及濕度(50±2)%的環(huán)境條件下喂養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已由動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，審批號(hào)為42010200005879。

1.2 藥物及試劑

地錦草(購(gòu)買(mǎi)于湖北省宜昌市中醫(yī)醫(yī)院)，由天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué))汪鋆植教授進(jìn)行鑒定，藥材基源鑒定合格；高脂飼料參照課題組前期方法制備[12]；葡聚糖硫酸鈉(DSS)(上海翊圣生物科技公司，貨號(hào)：60316ES76)；甘油三酯測(cè)定(GPO-PAP法)試劑盒，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(丙氨酸底物法)(中生北控生物科技股份有限公司)；TLR4抗體(Santa Cruz公司，貨號(hào)：SC-293072)；IL-1β抗體(Abcam公司，貨號(hào)：ab9722)；β-actin抗體(Cell Signaling公司，貨號(hào)：4970L)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)引物(生工生物工程股份有限公司)；高效cDNA鏈合成試劑盒(南京Vazyme生物科技有限公司，貨號(hào)：R312-01)；通用型高靈敏度染料法定量PCR檢測(cè)試劑盒(南京Vazyme生物科技有限公司，貨號(hào)：Q311-02)。

1.3 主要儀器

電泳儀(美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；ChemiScope化學(xué)發(fā)光凝膠成像顯影設(shè)備(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)；TS100顯微鏡(日本Nikon尼康公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 地錦草提取物的制備

傳統(tǒng)中草藥一般用煎煮法，所以水提法通常采用熱水浸出法，利用“相似相溶”的原理進(jìn)行提取，能夠比較完整地保留成分[10]。將總重量為200 g的地錦草進(jìn)行粉碎，加入相當(dāng)于藥物8倍量的蒸餾水并浸泡30 min，加熱至沸騰，再繼續(xù)煮20 min，過(guò)濾；將獲得的藥渣按照上面方法再重復(fù)2次，提取濾液。然后將3次的濾液合并在一起進(jìn)行濃縮，濃縮完后將其凍干成粉末狀，最后獲得50.5 g提取物。地錦草藥物的提取率為25.3%，每克提取物相當(dāng)于4.0 g的生藥量[13]。應(yīng)用HPLC指紋圖譜分析地錦草提取物，獲得多個(gè)峰。根據(jù)文獻(xiàn)[7]提示沒(méi)食子酸具有抗炎及調(diào)節(jié)miRNA作用，且地錦草提取物中有豐富沒(méi)食子酸，因此選取沒(méi)食子酸作為參照品。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法對(duì)特征性峰進(jìn)行指認(rèn)，確定地錦草提取物含量最高的特征性成分為沒(méi)食子酸。

1.4.2 動(dòng)物分組、造模及給藥

SPF級(jí)別C57BL/6小鼠雌雄對(duì)半隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組(control，Con)，利用HFD和DSS建立的小鼠NASH模型組(model，Mod)，地錦草提取物低劑量給藥組(EHW-L，2.5 g/kg)，地錦草提取物高劑量給藥組(EHW-H，7.5 g/kg)[14]。在總共為期14 d的試驗(yàn)周期內(nèi)，對(duì)NC組喂食普通無(wú)添加飼料。模型組和藥物組均給予高脂飼料2周。在該時(shí)期對(duì)正常對(duì)照組和模型組進(jìn)行無(wú)菌生理鹽水灌胃，而有關(guān)藥物組根據(jù)相應(yīng)劑量進(jìn)行地錦草提取液灌胃給藥。從第8 d開(kāi)始，模型組和藥物組均將正常飲水換為濃度為2%的DSS飲水，持續(xù)飲用DSS水7 d。

1.4.3 小鼠血清生化標(biāo)志物檢測(cè)

留取小鼠眼球血，并分離出上清開(kāi)展后續(xù)生化指標(biāo)檢測(cè)。使用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)血清中甘油三酯(triglyceride，TG)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)含量，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度大小計(jì)算出目標(biāo)底物的含量。

1.4.4 小鼠肝臟組織H&E染色

新鮮肝臟組織用低溫磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，切取肝大葉中長(zhǎng)度和厚度均適中的一部分放入包埋夾內(nèi)，用4%多聚甲醛固定24 h，后常規(guī)脫水處理，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。然后將切片進(jìn)行蘇木精伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)，普通光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)情況。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

取小鼠部分肝組織約30～50 mg，利用Trizol試劑提取總RNA。測(cè)量RNA樣品的濃度和純度。根據(jù)第一鏈合成cDNA合成試劑盒來(lái)合成其cDNA用于RT-PCR擴(kuò)增。其中 miR-106-5p GGTGGTTCACAAAGCCCATACCAGTGCAGGGTCCGAGGT-為莖環(huán)引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，U6作為內(nèi)參，經(jīng)qPCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。相應(yīng)的所有引物序列如表1所示。qPCR反應(yīng)條件為：兩步法變性95 ℃ 20 s、退火60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線檢測(cè)從60 ℃到95 ℃，每0.5 ℃讀取1次，若為單峰時(shí)說(shuō)明引物特異性良好。利用軟件qPCRsoft (RealTime PCR Application)分析，計(jì)算2-△△CT分析相關(guān)基因的表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

續(xù)表1(Continued Tab.1)

1.4.6 Western blot

冷凍的肝臟組織在冰冷RIPA 蛋白裂解液中均質(zhì)化。4 ℃條件下靜置30 min，12 000 r/10 min后取上清液用于蛋白印跡分析。將提取的總蛋白經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定濃度，每個(gè)蛋白樣品上樣量為30 μg。加入loading buffer，100 ℃水浴10 min變性。等量的樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，采用濕法轉(zhuǎn)膜法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯PVDF膜上。使用麗春紅染料檢驗(yàn)蛋白是否轉(zhuǎn)移至膜上。后續(xù)用5%脫脂牛奶于脫色搖床封閉90 min、4 ℃一抗孵育過(guò)夜、室溫孵育二抗。試驗(yàn)期間每敷完抗體后需用TBST洗膜。最后在膜上均勻覆蓋顯影液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像觀察蛋白條帶。用Image J軟件分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.4.7 miRNA預(yù)測(cè)

TargetScan(網(wǎng)址：http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè)以TLR4為靶基因的miRNA。哺乳動(dòng)物中的miRNA通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄本序列的3′UTR區(qū)，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。而TargetScan是一個(gè)專門(mén)分析哺乳動(dòng)物miRNA靶基因的軟件，并且根據(jù)已有的分析結(jié)果整理成了數(shù)據(jù)庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)查找TLR4相關(guān)miRNA，然后與棕櫚酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷細(xì)胞模型的miRNA芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行交集，獲得靶向TLR4的miR-106-5p。

1.4.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 地錦草提取物改善NASH病理?yè)p傷

2.1.1 地錦草提取物顯著改善NASH的脂質(zhì)代謝

通過(guò)給予小鼠葡聚糖硫酸鈉DSS-高脂飲食從而在短期內(nèi)迅速建立NASH動(dòng)物模型并收集小鼠血清，采用肝功能生化試劑盒檢測(cè)小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)與甘油三酯(TG)的含量變化。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組血清中的ALT與TG含量均顯著上升，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明模型組小鼠肝臟功能具有一定的損害。然而藥物組通過(guò)低劑量和高劑量地錦草提取物干預(yù)后，與模型組比較，給藥組小鼠血清中的TG和ALT的含量均有所下降(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

圖1 地錦草提取物對(duì)HFD+DSS致NASH脂質(zhì)代謝的影響Fig.1 Effects of E.humifusa extract on lipid metabolism of HFD+DSS induced 注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，下同。Note:Compared with Con,#P<0.05;Compared with Mod,*P<0.05,the same below.

2.1.2 地錦草提取物改善小鼠肝臟組織病理?yè)p傷

肝臟活檢是檢驗(yàn)非酒精性脂肪性肝炎的金標(biāo)準(zhǔn)，利用蘇木精伊紅染色檢測(cè)HFD和DSS對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)的影響。H&E染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組的肝切片中肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)邊界清晰，肝細(xì)胞呈放射狀分布于中央靜脈周圍，肝竇清晰可見(jiàn)。圖中黑色方框所指為脂質(zhì)變性和炎性浸潤(rùn)。模型組小鼠肝細(xì)胞腫脹變大，肝索結(jié)構(gòu)混亂無(wú)規(guī)則，出現(xiàn)脂肪空泡的數(shù)量多。此外還可以觀察到炎性細(xì)胞聚集成片并伴有明顯的炎性浸潤(rùn)，肝小葉內(nèi)伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(達(dá)到NASH診斷標(biāo)準(zhǔn))。而在通過(guò)地錦草提取物處理后，鏡下觀察可見(jiàn)肝細(xì)胞形態(tài)逐漸清晰，排列更為緊密，脂肪空泡顯著減少、氣球樣變和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重程度下降。總之，藥物組肝細(xì)胞與模型組相比形態(tài)有所恢復(fù)，脂肪變性和炎性程度也同樣降低。并且在高劑量的藥物組中肝索結(jié)構(gòu)愈發(fā)清晰有序(見(jiàn)圖2)。提示地錦草提取物對(duì)小鼠肝組織脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)有一定的改善作用。

圖2 地錦草提取物對(duì)HFD+DSS致NASH的肝組織病理學(xué)的影響(H&E染色，×400)Fig.2 Effects of E.humifusa on liver histopathology of HFD+DSS induced NASH (H&E staining,×400)

2.2 地錦草提取物調(diào)節(jié)miR-106-5p/TLR4信號(hào)通路的表達(dá)

2.2.1 小鼠肝組織中miR-106-5p和TLR4的表達(dá)情況

有文獻(xiàn)報(bào)道稱非酒精性脂肪性肝病與肝臟代謝的徹底重編程有關(guān)。表觀遺傳機(jī)制，特別是與microRNA表達(dá)和活性失調(diào)相關(guān)的機(jī)制，在與NAFLD相關(guān)的代謝紊亂及向著疾病更嚴(yán)重階段的進(jìn)展中起重要作用[15]。結(jié)合課題前期獲取的棕櫚酸處理的肝細(xì)胞miRNA芯片數(shù)據(jù)庫(kù)。在本研究中為了探索NASH中靶向調(diào)節(jié)TLR4的miRNA，使用生物信息學(xué)軟件Targetscan預(yù)測(cè)。將前期芯片數(shù)據(jù)庫(kù)同預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行交集，篩選到在細(xì)胞模型中明顯低表達(dá)的miR-106-5p確定為本文的研究對(duì)象。miR-106-5p與TLR4的3′-UTR區(qū)結(jié)合如圖3A所示?；赥LR4和miR-106-5p在肝炎中的作用，推測(cè)TLR4和miR-106-5p具有相關(guān)性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該假設(shè)，隨后通過(guò)檢測(cè)小鼠肝組織中miR-106-5p及TLR4的表達(dá)情況。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果可看出，在高脂飲食和DSS雙重誘導(dǎo)下小鼠肝組織中miR-106-5P表達(dá)受到抑制，而TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)含量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖3B～3D)，這一現(xiàn)象提示在脂肪性肝炎發(fā)病發(fā)展中，肝組織內(nèi)miR-106-5p和TLR4可能具有調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步分析藥物對(duì)miR-106-5p和TLR4的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，地錦草提取物低、高劑量組miR-106-5p的表達(dá)明顯上升，而miR-106-5p靶向的基因TLR4無(wú)論是轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的表達(dá)均明顯下降(見(jiàn)圖3B～3D)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖3D)。根據(jù)以上在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到的TLR4表達(dá)水平的變化趨勢(shì)，提示地錦草提取物可能具有調(diào)節(jié)miR-106-5p/TLR4活性的作用。

圖3 地錦草提取物調(diào)節(jié)miR-106-5p/TLR4表達(dá)Fig.3 The extract of E.humifusa regulated the expression of

2.2.2 小鼠肝臟組織中炎癥因子的表達(dá)情況

IL-1β、TNF-α被認(rèn)為是NASH進(jìn)展的主要細(xì)胞因子。同時(shí)TNF-α和IL-6，IL-1β也是作為T(mén)LR4信號(hào)通路的下游。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中IL-6和TNF-α炎性因子的表達(dá)水平明顯上升(見(jiàn)圖4A～4C)。此外Western blot結(jié)果顯示，模型組中IL-1β蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05)。但通過(guò)不同劑量的地錦草提取物進(jìn)行治療后，給藥組中炎性因子IL-6 和TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著下降，IL-1β蛋白表達(dá)水平也明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)圖4A～4D)。以上結(jié)果提示了作為通路下游的炎性因子TNF-α和IL-6、IL-1β與miR-106-5p可能在NASH發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有一定的作用，地錦草提取物可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-106-5p/TLR4信號(hào)通路改善NASH。

圖4 地錦草提取物調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路Fig.4 The extract of E.humifusa regulated TLR4 signaling

3 討論與結(jié)論

高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用，但單純的飲食誘導(dǎo)需數(shù)月才能顯示出明顯的肝臟炎癥表型，則較長(zhǎng)的建模周期對(duì)藥物篩選有諸多限制因素。在高脂飲食基礎(chǔ)上加入葡聚糖硫酸鈉(DSS)可通過(guò)腸道炎癥會(huì)加劇高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型[16]。Kwon等[17]發(fā)現(xiàn)接受DSS處理的小鼠表現(xiàn)出腸道屏障功能相關(guān)蛋白的表達(dá)降低和血漿LPS水平升高，表明在DSS誘導(dǎo)下的腸道屏障功能障礙。同時(shí)這些小鼠也表現(xiàn)出肝臟脂肪堆積和炎癥表型，促進(jìn)NASH的發(fā)生發(fā)展[18-20]。課題組前期實(shí)驗(yàn)[13]也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用HFD和DSS喂養(yǎng)小鼠，高脂飲食誘發(fā)的脂質(zhì)沉積和葡聚糖硫酸鈉導(dǎo)致的腸道屏障受損，可在短時(shí)間內(nèi)發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎?？傊?，使用此方法可在短期內(nèi)完全建立NASH體內(nèi)模型，適合于有關(guān)藥物的篩選工作及機(jī)制研究[21,22]。

有研究報(bào)道在急性肺損傷(ALI)小鼠模型中，LPS刺激的巨噬細(xì)胞的肺組織中miR-106a 的表達(dá)顯著降低。miR-106a可通過(guò)靶向TLR4表達(dá)來(lái)抑制NF-κB活化及其下游的炎性因子的產(chǎn)生[23]。高糖(25 mmol/L)可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中HMGB1的表達(dá)增加及 miR-106的表達(dá)降低，介導(dǎo)HUVEC 凋亡和炎癥因子的表達(dá)?？傊?，這些數(shù)據(jù)共同表明 miR-106表達(dá)降低可活化炎癥反應(yīng)信號(hào)通路[24]。我們的研究結(jié)果也證明在NASH小鼠模型中，肝臟組織的miR-106a低表達(dá)以及TLR4高表達(dá)，從而介導(dǎo)NASH發(fā)生發(fā)展。給予地錦草提取物后，結(jié)果ALT、TG的水平降低；肝組織中TNF-α的mRNA水平降低，病理?yè)p傷程度減輕。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在模型組的肝組織miR-106-5p低表達(dá)，miR-106-5p靶向的TLR4表達(dá)上調(diào)，繼而觀察到TLR4信號(hào)通路下游的TNF-α、IL-1β和IL-6在肝組織中明顯增高。藥物干預(yù)后可導(dǎo)致miR-106-5p的表達(dá)升高，抑制TLR4信號(hào)通路。

綜上所述，地錦草提取物可以改善高脂和葡聚糖硫酸鈉飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎，其改善非酒精性脂肪性肝炎的作用機(jī)理可能是通過(guò)調(diào)節(jié)miR-106-5p的表達(dá)，來(lái)抑制靶向的TLR4信號(hào)通路所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而改善炎癥性肝損傷，為NASH治療藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。