王麗萍，高彩雯，馮海月，曾嵩玉，陳士恩

1西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院；2西北民族大學(xué)生物研究中心 中國(guó)-馬來西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730124

糖尿病是一種常見疾病，分為1型糖尿病(diabetes mellitus type 1，T1DM)和2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)2種類型，T2DM占糖尿病患者90%以上，主要由胰島素抵抗、胰島素分泌異常而導(dǎo)致的餐后血糖升高引起[1]。α-葡萄糖苷酶是引起餐后血糖升高的主要酶之一，抑制α-葡萄糖苷酶活性已成為控制餐后血糖、治療T2DM的主要途徑[2]。目前臨床所用α-葡萄糖苷酶抑制劑多為阿卡波糖、米格列醇等，雖抑制活性較高，但價(jià)格昂貴且易引發(fā)消化不良等一系列胃腸道反應(yīng)[3]。植物來源的天然產(chǎn)物因其毒性和副作用小成為治療劑的優(yōu)質(zhì)來源，因此，從天然活性物質(zhì)中尋找安全、不良反應(yīng)小的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究熱點(diǎn)。

紅景天作為傳統(tǒng)藥食同源性中藥材之一，含紅景天苷、兒茶素、酪醇等多種活性成分[4]，目前國(guó)內(nèi)外研究主要集中于抗缺氧[5]、抗凋亡[6]、抗腫瘤[7]、緩解應(yīng)激損傷[8]等方面，也有研究表明，其在糖尿病嚙齒動(dòng)物模型中具有一定作用[9,10]，可通過激活5'-單磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)相關(guān)信號(hào)通路緩解糖尿病小鼠的高血糖、高血脂、尿糖癥狀[11]。近日研究人員發(fā)現(xiàn)紅景天提取物可顯著降低小鼠的餐后血糖水平[12]，其活性成分在體外表現(xiàn)出一定程度的抑制作用，但具體抑制方式并不明確。我們團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)紅景天中多酚類物質(zhì)具有一定體外α-葡萄糖苷酶抑制活性[13]。基于上述研究背景，本研究結(jié)合酶抑制動(dòng)力學(xué)、UHPLC-QE-MS、分子對(duì)接技術(shù)，以可視化的方式探索紅景天提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。研究旨為降血糖藥物、保健食品的開發(fā)提供理論參考，以期促進(jìn)紅景天的進(jìn)一步開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大花紅景天Rhodiolacrenulata(HK.f.et Thoms.) H.Ohba采自西藏昌都，經(jīng)西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院陳士恩教授鑒定為真；無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、甲醇(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4′-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，PNPG)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，美國(guó)Sigma公司)；α-葡萄糖苷酶(G5003-100UN，美國(guó)Sigma公司)；阿卡波糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，美國(guó)Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)(北京索萊寶科技有限公司)；甲醇、乙腈(LC-MS級(jí)，CNW Technologies)；乙酸銨(LC-MS級(jí)，SIGMA-ALDRICH)；乙酸(fisher chemical)，水為超純水。

L8型紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；1510型酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；DL1500型超聲波提取儀(中科都菱公司)；LGJ-20F型冷凍干燥機(jī)(日本松源華興科技有限公司)；X1R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Vanquish超高效液相色譜(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)液相色譜柱(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅景天提取物的制備

將紅景天根、莖洗凈后于烘箱中100 ℃烘干、粉碎、過50目篩，得紅景天粉末，放入干燥器皿中備用。精密稱取紅景天粉末于三角瓶中，加入50%乙醇，進(jìn)行超聲提取，結(jié)束后將固體與液體10 000 r/min離心5 min，取上清液即可，將所得提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮體積至1/3，真空冷凍干燥后得紅景天提取物(R.crenulataextract，RCE)。

1.2.2 RCE體外α-葡萄糖苷酶活性抑制測(cè)定

用超純水將RCE溶解且稀釋至不同濃度后，進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)[14]。取10 μL適量質(zhì)量濃度的RCE溶液與45 μL 5U/mLα-葡萄糖苷酶磷酸鹽溶液(0.2 mol/L，pH=5.0)振蕩混勻后于54 ℃培養(yǎng)箱孵育10 min。加入45 μL 2.5 mol/L PNPG溶液開始啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩混勻，54 ℃孵育 30 min后，加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，振蕩混勻后，于波長(zhǎng)405 nm測(cè)定吸光度。

以PBS替代α-葡萄糖苷酶溶液測(cè)定樣品空白；以PBS替代供測(cè)樣品測(cè)定酶液空白。按照以下公式計(jì)算抑制率，并用SPSS件求出相應(yīng)的半抑制濃度。

式中：Ac為未添加樣品反應(yīng)液的吸光值；A0為酶液空白吸光值；AS為添加樣品反應(yīng)液的吸光值；Ab為樣品空白吸光值。

1.2.3 酶抑制動(dòng)力學(xué)測(cè)定

以酶濃度為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)初速率V(ΔOD/min)為縱坐標(biāo)作圖，以判斷其是否為可逆抑制；以底物濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速率的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo)，得Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，判斷其抑制類型，并計(jì)算米氏常數(shù)(Km)及最大反應(yīng)速率(Vmax)。

1.2.4 RCE的UHPLC-QE-MS檢測(cè)

精密稱取25 mg RCE，加入500 μL提取液(甲醇∶水=3∶1(V/V)，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物)；35 Hz研磨處理4 min，超聲5 min(冰水浴)，重復(fù)3次；-40 ℃靜置1 h；將樣品4 ℃，12 000 r/min，離心15 min；取上清于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)。

色譜條件：Vanquish超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相為：含5 mmol/L乙酸銨的5 mmol/L乙酸水溶液(A相)和乙腈(B相)，樣品室溫度：4 ℃，柱溫箱溫度40 ℃，流速0.35 mL/min，進(jìn)樣體積：2 μL，洗脫程序：0～1 min，30% B；1 min～12 min，30%→100% B；12～15 min，100% B。

質(zhì)譜條件：Thermo Q Exactive HFX質(zhì)譜儀進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，離子源為電噴霧離子源(ESI)，在正離子與負(fù)離子下進(jìn)行質(zhì)譜分析。詳細(xì)參數(shù)如下：鞘氣流速：30 Arb,輔助氣體流速：10 Arb，毛細(xì)管溫度：350 ℃，F(xiàn)ull MS分辨率：120 000，MS/MS分辨率：7 500，碰撞能量：10/30/60，噴霧電壓：4.0 kV(+)或-3.8 kV(-)，掃描范圍：m/z50～1 500 Da。

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包(內(nèi)核為XCMS)進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理，然后與BiotreeDB(V2.1)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。

1.2.5 RCE活性成分與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org)下載α-Glucosidase(PDB ID：3WY1)的結(jié)晶復(fù)合物，使用PyMOL軟件對(duì)去除其水分子及原配體，保存為PDB格式，再使用AutodockTools1.5.6進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷等，保存為PDBQT格式備用。從ZINC(http://zinc.docking.org/)小分子數(shù)據(jù)庫(kù)中下載RCE 20種化合物的結(jié)構(gòu)(mol2格式)，并使用AutodockTools1.5.6進(jìn)行處理，保存為PDBQT格式備用。采用Autodock預(yù)測(cè)化合物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合，采用軟件默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行對(duì)接，并計(jì)算活性成分與靶點(diǎn)蛋白的最低結(jié)合能，最后使用PyMOL將分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性如圖1所示，結(jié)果表明，RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定抑制能力，且抑制率隨濃度增加而逐漸增加，并呈量效關(guān)系。其半數(shù)抑制濃度IC50為1.538 mg/mL，低于陽性對(duì)照阿卡波糖(IC50為3.36 mg/mL)。當(dāng)RCE濃度為50 mg/mL時(shí)，抑制率可達(dá)95%，具有良好的抑制效果。

圖1 RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of RCE on α-glucosidase

2.2 RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制

不同RCE濃度下，以酶濃度([E])對(duì)反應(yīng)初速率([V])作圖，所得結(jié)果(見圖2)為一組經(jīng)過原點(diǎn)的直線，且所有直線存在較好的線性關(guān)系。添加RCE的直線斜率均小于未添加RCE直線斜率，隨著提RCE濃度增加，直線斜率逐漸減小，表明RCE添加并沒有改變酶數(shù)量，而是通過降低酶活性使得分解底物能力降低，因此RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Lin[15]研究結(jié)果較為一致。RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖如圖3所示，抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示，LB直線交于第二象限，隨著RCE濃度增加，酶促反應(yīng)最大反應(yīng)速率Vmax減小，米氏常數(shù)Km增大，因此RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制類型。

表1 RCE 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Inhibitory kinetic parameters of RCE on α-glucosidase

圖2 酶濃度與反應(yīng)初速率圖Fig.2 Graph of enzyme concentrationand initial reaction rate

圖3 RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.3 Lineweaver-Burk double-reciprocal plot of RCE inhibiting α-glucosidase

2.3 RCE的UHPLC-QE-MS分析

采用UHPLC-QE-MS對(duì)RCE進(jìn)行成分分析，總離子流圖(TIC)如圖4所示，圖中A為正離子模式，圖B為負(fù)離子模式。對(duì)TIC進(jìn)行提取后根據(jù)化合物保留時(shí)間和碎片離子峰等信息，結(jié)合BiotreeDB(V2.1)、HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)RCE化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，共檢測(cè)出1 245種化合物，負(fù)離子模式下263種，正離子模式下982種。其中氨基酸類66種，醇類8種，脂肪酸類107種，黃酮類及異黃酮類78種，生物堿類42種，酚類34種，萜類及其衍生物85種，核苷酸及其衍生物10種，甾體類36種，糖類及其衍生物44種，木脂素類40種，芳香類66種，苯丙素類22種，有機(jī)酸類23種，香豆素類31種，脂肪酰類47種及其他類。以色譜峰的面積代表該物質(zhì)的相對(duì)含量，篩選出相對(duì)含量較高的20種物質(zhì)，如表2所示：其中黃酮類有7種，脂肪酸類有3種，糖類2種，有機(jī)酸類2種等。

表2 RCE中相對(duì)含量較高的20種化合物Table 2 Twenty compounds with high relative content in RCE

續(xù)表2(Continued Tab.2)

圖4 RCE的UHPLC-QE-MS總離子流圖Fig.4 Total ion chromatograms of RCE by UHPLC-QE-MS

2.4 RCE活性成份與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接

近年來，分子對(duì)接方法已成為計(jì)算機(jī)輔助藥物研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)，也廣泛應(yīng)用于天然化合物虛擬篩選。分子對(duì)接技術(shù)是研究分子間(如配體和受體)相互作用，并預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法，涉及分子間的空間匹配與能量匹配。采用Auto Dock將紅景天提取物中含量較高的20種活性成分與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行分子對(duì)接，并預(yù)測(cè)其結(jié)合能(binding energy)。結(jié)合能越低，對(duì)接物構(gòu)象越穩(wěn)定，活性成分與蛋白結(jié)合越牢固，親和力越好；結(jié)合能低于0 kJ/mol表明分子間具有結(jié)合活性；結(jié)合能低于-20.93 kJ/mol時(shí)，表明分子間具有較強(qiáng)結(jié)合能力[16]。結(jié)果表明，RCE的20種化合物有11種可與α-葡萄糖苷酶的氨基酸殘基通過氫鍵進(jìn)行結(jié)合(表3)。其中咖啡酸形成的氫鍵最多，為5個(gè)，可與His-515、Arg-437、Glu-432及His-348 4個(gè)氨基酸殘基相連；(+)-表兒茶素結(jié)合能最低(-17.08 kJ/mol)，與Asn-443、His-515殘基形成的鍵長(zhǎng)分別為2.2、2.4，其結(jié)合性最好；咖啡酸、L-蘋果酸、槲皮素和酪醇具有相同結(jié)合位點(diǎn)Arg-437；(-)-epicatechin 3-O-gallate、咖啡酸和(+)-表兒茶素具有相同結(jié)合位點(diǎn)His-515，山奈酚和紅景天苷具有相同結(jié)合位點(diǎn)Asn-46。分子對(duì)接結(jié)果從理論上驗(yàn)證了紅景天提取物中化合物與α-葡萄糖苷酶具有一定的結(jié)合活性，并明確了可能進(jìn)行結(jié)合的具體化合物(見圖5)。

表3 化合物與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of compounds and α-glucosidase

圖5 化合物與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接可視化結(jié)果Fig.5 Visualization results of molecular docking between compounds and α-glucosidase注：圖中黃色虛線代表氫鍵，綠色表示α-葡萄糖苷酶蛋白結(jié)構(gòu)，藍(lán)色表示化合物結(jié)構(gòu)。A：木犀草素；B：紅景天苷；C：山奈酚；D：(-)-Epicatechin 3-O-gallate ；E：咖啡酸；F：L-蘋果酸；G：(+)-表兒茶素；H：槲皮素；I：(-)-Erythro-anethole glycol 1-glucoside；J：3-Hydroxy-4,6-heptadiyne-1-yl 1-glucoside；K：酪醇。Note:The yellow dotted line in the figure represents hydrogen bonds,green represents the protein structure of α-glucosidase,and blue represents the compound structure.A:Luteolin;B:Salidroside;C:Kaempferol;D:(-)-Epicatechin 3-O-gallate;E:Caffeic acid;F:L-Malic acid;G:(+)-Epicatechin;H:Quercetin;I：(-)-Erythro-anethole glycol 1-glucoside;J:3-Hydroxy-4,6-heptadiyne-1-yl 1-glucoside;K:Tyrosol.

3 討論與結(jié)論

α-葡萄糖苷酶存在于機(jī)體小腸黏膜刷狀緣，可將寡糖或二糖分解為單糖，抑制其活性可減緩碳水化合物水解和葡萄糖生成速率，從而降低小腸對(duì)葡萄糖的吸收及餐后血糖。研究表明星蘋果、象腿蕉、黑枸杞、五味子、紫山藥、黔產(chǎn)蒲公英[17]等多種植物提取物均對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制活性。半數(shù)抑制濃度(IC50)可以評(píng)判抑制劑對(duì)酶的抑制效果，IC50越小，抑制活性越高，團(tuán)隊(duì)前期研究表明，紅景天多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制效果[13]，IC502.83 mg/mL，本實(shí)驗(yàn)所得RCE IC50為1.538 mg/mL，不僅低于阿卡波糖，而且低于紅景天多酚，這可能是由于RCE中還含有黃酮類、有機(jī)酸類等物質(zhì)。抑制劑對(duì)酶的抑制類型可分為可逆抑制與不可逆抑制，本研究所得RCE與α-葡萄糖苷酶為可逆抑制，這種抑制類型特點(diǎn)是抑制物與酶的結(jié)合方式為非共價(jià)鍵結(jié)合，通過物理方法可使酶恢復(fù)活性，可逆抑制類型又可分為4類，分別為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制、混合型抑制，混合型抑制類型有競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性混合型，該類型特點(diǎn)為抑制物濃度的增加會(huì)使酶促反應(yīng)最大反應(yīng)速率(Vmax)減小，米氏常數(shù)(Km)增大，本研究顯示RCE濃度增大后Vmax減小、Km增大，符合上述特點(diǎn)，因此確定RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制，表明紅景天提取物是一種有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑。RCE與紅景天多酚、五味子多糖和網(wǎng)地藻多糖[18]對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型一致，但需明確哪種化合物屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制，哪種化合物屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制還需進(jìn)一步探究。RCE具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但在體內(nèi)是否效果顯著還需進(jìn)一步動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證。目前α-葡萄糖苷酶的來源較多，主要有釀酒酵母、黑曲霉、嗜熱脂肪芽孢桿菌、腸膜明串珠菌等。不同來源α-葡萄糖苷酶的性質(zhì)相差較大，本研究所用α-葡萄糖苷酶為釀酒酵母來源，因此RCE是否對(duì)其他來源酶具有相同的抑制效果還需進(jìn)一步探究。

UHPLC-QE-MS具有快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可非靶標(biāo)分析復(fù)雜中藥材中的化合物，本研究對(duì)RCE進(jìn)行分析，通過與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比鑒定出1 245種化合物，負(fù)離子模式下263種，正離子模式下982種。紅景天活性成分提取溶劑主要為乙醇和水，與純水相比有機(jī)溶劑的水溶液可提取出更多化合物，水提物中沒食子酸含量高于醇提物，酪醇、綠原酸和單寧含量低于水醇提取物[19]，因此本實(shí)驗(yàn)為提取出更多種化合物，以50%乙醇作為溶劑進(jìn)行RCE提取制備。但由于提取溶劑的單一，檢測(cè)出的化合物并不一定是紅景天全部化合物，還存在部分化合物不能被提取或鑒定，因此還需進(jìn)一步增加不同提取溶劑的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。Zakharenko[20]研究表明，紅景天中主要活性成分為紅景天苷、木犀草素、兒茶素、槲皮素、草本素、沒食兒茶素等，這與本研究結(jié)果較為一致，RCE中具有較高含量的木犀草素、槲皮素。分子對(duì)接可預(yù)測(cè)小分子配體與受體蛋白之間是否可發(fā)生結(jié)合及結(jié)合的作用力，本研究將UHPLC-QE-MS所得20種含量較高的化合物與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果表明11種化合物可與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，分別為木犀草素、紅景天苷、山奈酚、(-)-epicatechin 3-O-gallate、咖啡酸、L-蘋果酸、(+)-表兒茶素、槲皮素、(-)-erythro-anethole glycol 1-glucoside、3-hydroxy-4,6-heptadiyne-1-yl 1-glucoside、酪醇，其中咖啡酸形成氫鍵最多，可與His-515、Arg-437、Glu-432、His-348殘基結(jié)合。(+)-表兒茶素與Asn-443和His-515具有最佳的結(jié)合活性，結(jié)合能最低(-17.08 kJ/mol)；將PNPG與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行對(duì)接，發(fā)現(xiàn)Arg-437和Glu-432為其2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，咖啡酸與PNPG擁有相同的結(jié)合位點(diǎn)Arg-437和Glu-432，L-蘋果酸、槲皮素和酪醇與PNPG具有相同的結(jié)合位點(diǎn)Arg-437，因此推斷咖啡酸、L-蘋果酸、槲皮素和酪醇對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型可能為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，其他6種化合物為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，但如需驗(yàn)證還需進(jìn)一步將化合物純化后做Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，分別確定其抑制類型。

綜上所述，本研究通過酶抑制動(dòng)力學(xué)、UHPLC-QE-MS、分子對(duì)接技術(shù)，以可視化的方式探索了RCE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制， RCE中(+)-表兒茶素與α-葡萄糖苷酶結(jié)合活性最佳。本文為RCE開發(fā)成為天然α-葡萄糖苷酶抑制劑及紅景天資源的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)研究。