張運(yùn)輝，楊夢(mèng)琳*，周小青，伍大華,3，劉 霞，李 祥

1重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶 404120；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；3湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410006

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和精神行為損害為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)變性病。隨著人口老齡化的進(jìn)程加快，我國(guó)AD的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅中老年人的健康，給社會(huì)、家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)。目前美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的抗AD藥物主要是N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體阻滯劑和乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)抑制劑，雖可適度改善患者的癥狀，但仍不能根治、逆轉(zhuǎn)AD的發(fā)展。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用特點(diǎn)，在改善AD患者認(rèn)知功能、提高日常生活能力與生活質(zhì)量方面具有顯著的療效，且毒副作用小，長(zhǎng)期服用不易耐藥[1]。

有學(xué)者將AD稱(chēng)為腦內(nèi)的3型“糖尿病”并指出AD的核心可能是由于腦胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)通路障礙所引起的[2]。研究證實(shí)，糖尿病是AD的一個(gè)非常重要的高危因素，糖尿病患者并發(fā)AD的風(fēng)險(xiǎn)也非常高，且有不少AD患者同時(shí)合并糖尿病[3]，這極大增加了患者的痛苦，并給臨床治療帶來(lái)更大的難度。黃芪散源自《圣濟(jì)總錄》，是治療消渴病的經(jīng)典方，由葛根、黃芪、桑白皮組成。研究發(fā)現(xiàn)[4]，黃芪散可降低糖尿病小鼠的空腹血糖、糖耐量，并降低腎上腺素引起的高血糖。實(shí)驗(yàn)證明黃芪散可改善5×FAD小鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間認(rèn)知功能障礙和AD樣病理[5]。中藥復(fù)方具有多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的協(xié)同作用特點(diǎn)，很難從整體到細(xì)胞再到分子水平進(jìn)行系統(tǒng)全面地闡釋。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)及生物信息學(xué)的新興學(xué)科，可整體系統(tǒng)地分析“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”之間的相互關(guān)系，能從分子層面和整體的角度闡明中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制[6]，從而為中藥復(fù)方有效成分的篩選和作用機(jī)制的研究提供技術(shù)支撐，且與中醫(yī)治病整體原則及中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路徑協(xié)同作用特點(diǎn)高度契合。

黃芪散有效成分眾多，作用靶點(diǎn)豐富，但黃芪散治療AD的有效成分及作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)黃芪散的有效成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，并借助細(xì)胞試驗(yàn)加以驗(yàn)證，試圖在分子水平探究黃芪散治療AD的作用機(jī)制，以期為深入開(kāi)展黃芪散基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究以及臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 黃芪散有效成分及靶點(diǎn)的篩選

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http ://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)篩選黃芪散(葛根、黃芪、桑白皮)中各味中藥的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類(lèi)藥性(drug likeness，DL)篩選出符合條件的候選活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，將OB≥30%及DL≥0.18設(shè)為篩選條件，并根據(jù)文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充黃芪散中有明確治療AD藥理活性的有效成分，將檢索所得各個(gè)主要成分于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選相關(guān)靶點(diǎn)。采用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)將獲得的黃芪散有效成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白名轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因靶點(diǎn)名稱(chēng)。

1.2 AD疾病相關(guān)基因檢索

以“阿爾茨海默病”的英文“Alzheimer′s disease”為關(guān)鍵詞在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://genealacart.genecards.org/)中篩選AD相關(guān)的基因，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中以得分>0.1作為篩選條件選擇相關(guān)基因，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)則選擇相關(guān)性分?jǐn)?shù)(relevance score≥30)的基因，并對(duì)檢索到的靶點(diǎn)進(jìn)行處理，之后將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)合并去重從而獲得最終AD的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芪散的有效成分與AD作用靶點(diǎn)上傳OmicShare平臺(tái)(https://www.omicshare.com/)進(jìn)行配對(duì)，得到疾病靶點(diǎn)與有效成分交集的靶點(diǎn)，再將這些交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”進(jìn)行操作，最小相互作用閥值設(shè)為“medium confidence=0.4”，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

將候選作用靶點(diǎn)PPI文件中的node1、node2、combined score上傳至Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的可視化處理，并使用工具中的 Network Analysis進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，主要根?jù)結(jié)果中的degree值的大小篩選，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG分析

用R語(yǔ)言軟件及Bioconductor插件，導(dǎo)入Venn圖共同靶點(diǎn)，使用cluster Profiler等處理數(shù)據(jù)，取P<0.05標(biāo)準(zhǔn)，以涉及的靶點(diǎn)數(shù)目多少進(jìn)行排序，選擇排名前20的進(jìn)行可視化展示，運(yùn)行R語(yǔ)言得到GO和KEGG富集分析的氣泡圖。

1.6 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芪散有效成分、對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建黃芪散有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.7 體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.7.1 細(xì)胞與試劑

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞(長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2015032007)；Aβ25-35(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)053M4804V)；多奈哌齊(衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號(hào) 190804)；ELISA測(cè)定試劑盒(武漢塞培生物科技有限公司，批號(hào)20190213)；ROS試劑盒(碧云天生物，批號(hào)041720200803)；PINK1抗體、parkin 抗體、p62抗體、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白G(Ig G)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ig G(美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)分別為00047643、00091761、00098963、00047316、SA00001-1、SA00001-2)；LC3Ⅱ/Ⅰ抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)11)；NLRP3抗體(Abclonal，批號(hào)3561487002)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，批號(hào)SH3002201)；10%新生小牛血清(Hyclone Lab，批號(hào)220118612)。黃芪散購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，取1劑，置于圓底燒瓶中，混勻，加入10倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，收集藥液，用4～6層紗布過(guò)濾，收集濾液，倒入容器。剩余藥渣再加入8倍量水，煎煮2次，每次各20 min，過(guò)濾，收集濾液。合并3次濾液，濃縮至生藥含量質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的黃芪散水煎劑，冷凍干燥成凍干粉，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，分為4組。對(duì)照組(加入不含F(xiàn)BS、PBS的DMEM培養(yǎng)基孵育48 h)、模型組(加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25-35[7]孵育48 h)、多奈哌齊組(20 μmol/L Aβ25-35+15 μmol/L鹽酸多奈哌齊)及黃芪散治療組(細(xì)胞模型+黃芪散處理組)。黃芪散組分別加入10、20、40、80、160、320 mg/L黃芪散繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用MTT法用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每個(gè)孔PC12細(xì)胞的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活率。

1.7.3 用顯微鏡觀察各組的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和突起長(zhǎng)度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞培養(yǎng)24 h后在培養(yǎng)基中加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25-35，顯微鏡下觀察處理后各組PC12細(xì)胞形態(tài)和統(tǒng)計(jì)細(xì)胞突起的長(zhǎng)度。

1.7.4 透射電鏡觀察PC12細(xì)胞自噬小體

PC12細(xì)胞以1×106接種于6孔板中，按照“1.7.2”項(xiàng)分組方法處理24 h后，棄掉培養(yǎng)液，PBS浸洗細(xì)胞3次，用0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞懸于PBS中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入3%透射電鏡專(zhuān)用戊二醛于4 ℃過(guò)夜避光固定PC12細(xì)胞4 h，透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.7.5 ELISA檢測(cè)PC12細(xì)胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α含量

PC12細(xì)胞以1×107接種于96孔板中，100 μL/孔，當(dāng)80%融合時(shí)，分別給予各組處理因素，每組3個(gè)復(fù)孔。按實(shí)驗(yàn)要求處理完成后，收集上清液留作待測(cè)標(biāo)本。采用ELISA測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)，按照ELISA測(cè)定試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.7.6 黃芪散對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS含量的影響

PC12細(xì)胞按照“1.7.2”項(xiàng)方法經(jīng)藥物作用48 h后，3 000 r/min在4 ℃條件下離心10 min 后，取上清，按照試劑盒操作測(cè)定ROS含量。

1.7.7 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

PC12 細(xì)胞按照“1.7.2”項(xiàng)方法經(jīng)藥物處理48 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的1×TBST封閉。分別加入PINK1、parkin、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ、NLRP3、BDNF一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌膜后加HRP標(biāo)記的二抗，避光室溫孵育1～2 h，采用ECL法檢測(cè)目的條帶，膠片曝光，顯影，以β-actin為內(nèi)參，分析結(jié)果。

1.7.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃芪散有效成分的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

從TCMSP中以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為條件，對(duì)黃芪散的有效成分進(jìn)行篩選，結(jié)合文獻(xiàn)查閱結(jié)果[8-10]，補(bǔ)充納入有較好治療AD藥理活性成分的黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ)、葛根素(puerarin)、白藜蘆醇(resveratrol)。最終篩選出44個(gè)有效成分(見(jiàn)表1)。其中黃芪12個(gè)，葛根5個(gè)，桑白皮32個(gè)，重復(fù)成分5個(gè)。

表1 黃芪散有效成分Table 1 Effective ingredients of Huangqisan

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 “有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Perl軟件整理數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建黃芪散及AD的有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖1)。利用Cyto Hubb插件得出排名前4位的核心有效成分為槲皮素、葛根素、黃芪甲苷和白藜蘆醇。

圖1 黃芪散有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Effective ingredients of Huangqisan-target network注：紅色菱形表示黃芪散的有效成分；藍(lán)色長(zhǎng)方形：靶基因。Note:Red diamond:Huangqisan compound;Blue rectangle:Target gene.

2.3 AD相關(guān)基因

在DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)AD的靶基因，共得到2 894個(gè)基因。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

將黃芪散-AD交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String網(wǎng)站，獲得PPI圖(見(jiàn)圖2)，其中節(jié)點(diǎn)數(shù)102、邊數(shù)1 124、平均節(jié)點(diǎn)度8.46、平均局部聚類(lèi)系數(shù)0.588；網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，連線代表蛋白質(zhì)之間的相互作用。鄰接節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)越多，成為關(guān)鍵基因的概率越大。其中排名前10的基因?yàn)镻INK1、NLRP3、BDNF、INSR、MTOR、OPTN、APP、CASP3、SOD2、GSK3B。

圖2 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of target protein

2.5 GO和KEGG結(jié)果

GO富集分析包括細(xì)胞成分、分子功能和生物過(guò)程3部分。將GO富集排名前20位制成氣泡圖(見(jiàn)圖3)，富集的GO功能主要包括自噬、炎癥反應(yīng)、對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)、對(duì)胰島素的反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡過(guò)程、氧化應(yīng)激反應(yīng)等。行KEGG通路富集分析制成氣泡圖(見(jiàn)圖4)。富集的KEGG通路主要包括線粒體自噬信號(hào)通路、胰島素抵抗、自噬、胰島素信號(hào)通路、阿爾茨海默病等。

圖3 GO功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis

圖4 KEGG通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis

2.6 黃芪散對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的影響

與空白組比較，模型組PC12細(xì)胞活率明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芪散組作用后，細(xì)胞活率顯著升高(P<0.05，P<0.01)。黃芪散各給藥組(10～80 mg/L)與模型組比較，細(xì)胞存活率均明顯升高。結(jié)果顯示黃芪散在80 mg/L具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且之后隨著濃度的升高其存活率增加幅度不明顯，因此后續(xù)研究中采用黃芪散80 mg/L進(jìn)行給藥(見(jiàn)表2)。

表2 黃芪散對(duì)Aβ25-35損傷 PC12細(xì)胞活率的影響Table 2 Effects of Huangqisan on the viability of PC12 cells injured by

2.7 各組PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)和突起長(zhǎng)度的改變

與對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且模型組細(xì)胞的突起明顯縮短甚至消失，外緣形狀變成鈍圓形，提示AD細(xì)胞模型構(gòu)建成功。與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量明顯增加，形狀為不規(guī)則多邊形，與對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)相似(見(jiàn)圖5)。與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的PC12細(xì)胞突起長(zhǎng)度明顯增加(P<0.05，P<0.01)(見(jiàn)表3)。

表3 各組PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)的比較Table 3 Comparison of synaptic growth of PC12 cells in each group

圖5 各組PC12細(xì)胞的形態(tài)(×800)Fig.5 The morphology of PC12 cells in each group (×800)注：A：對(duì)照組；B：模型組；C：多奈哌齊組；D：黃芪散組，下同。Note:A:Control group;B:Model group;C:Donepezil group;D:Huangqisan group,the same below.

2.8 黃芪散對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬小體的影響

對(duì)照組PC12細(xì)胞內(nèi)可明顯觀察到完整形態(tài)線粒體，同時(shí)整體細(xì)胞形態(tài)完整。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞經(jīng)Aβ25-35損傷后沒(méi)有出現(xiàn)典型的自噬小體，并且線粒體呈現(xiàn)空腔化改變，細(xì)胞整體形態(tài)發(fā)生變化。與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的PC12細(xì)胞自噬小體顯著增加，同時(shí)可觀察到較多被自噬小體包裹的受損線粒體，提示黃芪散可顯著激活PC12細(xì)胞的自噬(見(jiàn)圖6)。

圖6 透射電鏡檢測(cè)各組細(xì)胞自噬小體(×30 000)Fig.6 Transmission electron microscope for observing autophagosomes in all groups(×30 000)

2.9 各組PC12細(xì)胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α水平

與對(duì)照組比較，模型組PC12細(xì)胞IL-1β、IL-18和TNF-α水平均明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組PC12細(xì)胞的IL-1β、IL-18和TNF-α水平顯著減低(P<0.05，P<0.01)，提示黃芪散對(duì)PC12細(xì)胞的炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用(見(jiàn)表4)。

表4 各組PC12細(xì)胞IL-1β、IL-18和TNF-α水平的比較Table 4 Comparison of the levels of IL-1β,IL-18 and TNF-α in the supernatant of PC12 cells in each

2.10 黃芪散對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組PC12細(xì)胞ROS含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的PC12細(xì)胞ROS含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)(見(jiàn)表5)。

表5 黃芪散對(duì)ROS含量的影響Table 5 Effect of Huangqisan on contents of

2.11 黃芪散對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白及NLRP3、BDNF蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞PINK1、parkin、BDNF蛋白表達(dá)顯著降低，p62、LC3Ⅱ/Ⅰ、NLRP3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，黃芪散組、多哌奈齊組的PINK1、parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ、BDNF蛋白表達(dá)顯著升高，p62、NLRP3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05，P<0.01)(見(jiàn)圖7)。

圖7 黃芪散對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及NLRP3、BDNF蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of Huangqisan on the proteins expression of autophagy-related proteins and NLRP3,BDNF in Aβ25-35-induced PC12 cells

3 討論與結(jié)論

AD因其具有和1、2型糖尿病相似的發(fā)病機(jī)制，即主要體現(xiàn)在腦胰島素缺乏和胰島素抵抗，已被學(xué)術(shù)界稱(chēng)為“3型糖尿病”。糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)的消渴，以氣陰兩虛、燥熱內(nèi)盛為主，發(fā)展至后期則氣陰兩傷，陰陽(yáng)俱虛，變證百出。因此，益氣、養(yǎng)陰、清熱是治療消渴病的基本法則。黃芪散是治療消渴的經(jīng)典方，方中葛根生津止渴升脾中清陽(yáng)，輸津液以溉五臟而滋陰清熱；黃芪有補(bǔ)氣健脾，取其氣復(fù)津還，云行而雨施之意；桑白皮甘寒瀉火，滋陰潤(rùn)燥，且其甘寒之性以制黃芪稍熱之性；三藥配伍，共奏益氣健脾，養(yǎng)陰清熱，生津止渴之效，三消并治，從而起到標(biāo)本兼顧之效。

有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示黃芪散治療AD具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，結(jié)果顯示槲皮素、葛根素、黃芪甲苷和白藜蘆醇是其關(guān)鍵有效成分。研究證實(shí)槲皮素可通過(guò)經(jīng)典的雌激素受體通路及MAPK途徑增加Bcl-2/Bax表達(dá)比值及下降Caspase-3蛋白表達(dá)，從而減弱凋亡發(fā)生[11]。研究證明葛根素可有效減緩AD模型大鼠嗅球內(nèi)tau蛋白磷酸化水平的增加，其作用機(jī)制可能與其降低GSK-3β活性水平有關(guān)[12]。研究證明基于MEK5 /ERK5信號(hào)通路對(duì)AD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活性具有抑制作用，可拮抗AD大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]，白藜蘆醇可能通過(guò)促使海馬小膠質(zhì)細(xì)胞M2型極化進(jìn)而減輕炎性損傷改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙。

將有效成分和AD共同靶點(diǎn)相映射，得到藥物-疾病共同作用靶點(diǎn)102個(gè)。黃芪散關(guān)鍵靶點(diǎn)居前三位的是PINK1、NLRP3、BDNF。PINK1是PINK1/parkin信號(hào)通路的主要成員，研究發(fā)現(xiàn)[15]，激活PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬而影響AD病理，改善AD模型小鼠的認(rèn)知和記憶障礙功能。研究表明[16]，NLRP3炎癥小體可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)在AD發(fā)生發(fā)展中扮演十分重要的角色，NLRP3炎癥小體激活的兩個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志物IL-1β和IL-18在AD患者腦內(nèi)處于高水平狀態(tài)。BDNF作為一個(gè)重要的神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子，在突觸可塑性、神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)細(xì)胞存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。

GO富集分析顯示黃芪散治療AD的基因功能主要體現(xiàn)在自噬、炎癥反應(yīng)、對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)、對(duì)胰島素的反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡過(guò)程、氧化應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程。在本研究篩選出的信號(hào)通路中，與黃芪散有效靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度最高的是線粒體自噬信號(hào)通路，其次是胰島素抵抗。在本研究中，結(jié)合 AD的發(fā)病機(jī)制，篩選出預(yù)測(cè)結(jié)果中的線粒體自噬、炎癥反應(yīng)、突觸可塑性的調(diào)控機(jī)制為黃芪散對(duì)AD干預(yù)的可能機(jī)制開(kāi)展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。PINK1/parkin信號(hào)通路是調(diào)控線粒體自噬的關(guān)鍵通路，其作用方式為通過(guò)泛素化parkin以激活自噬[18]。PINK1為線粒體受損的主要探測(cè)器，當(dāng)線粒體受損時(shí)，PINK1在線粒體外膜磷酸化parkin將其從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)募集至受損線粒體，進(jìn)而磷酸化胞漿中的E3泛素蛋白連接酶parkin誘導(dǎo)其從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)向受損的線粒體外膜上募集，活化的parkin將泛素連接到底物蛋白上形成泛素鏈，與p62等結(jié)合以募集胞質(zhì)中的自噬標(biāo)志物L(fēng)C3，形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體[19]。自噬小體最后通過(guò)融合溶酶體將受損的線粒體完全降解，完成線粒體自噬的過(guò)程。LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化的程度越高，自噬小體數(shù)量就越多，自噬水平可以通過(guò)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ判斷[20]。p62能直接與LC3蛋白特定區(qū)域結(jié)合，并最終被自噬溶酶體選擇性降解，自噬發(fā)生時(shí)p62蛋白在自噬小體內(nèi)被降解[21]，因此p62蛋白的降解也是反映自噬水平的標(biāo)志之一。研究顯示[22]，線粒體自噬受損可能會(huì)引起Aβ和tau蛋白的積累，加劇氧化損傷，導(dǎo)致突觸功能障礙和認(rèn)知障礙。因此，線粒體自噬對(duì)AD具有十分重要的作用。研究證實(shí)通過(guò)激活PINK1/parkin通路促進(jìn)線粒體自噬可改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能障礙、增強(qiáng)線粒體的功能、起到神經(jīng)元保護(hù)的作用[23]。本研究結(jié)果表明黃芪散能增加自噬小體數(shù)量，促進(jìn)自噬小體包裹受損線粒體，升高LC3Ⅱ/Ⅰ比值，上調(diào)PINK1、parkin蛋白表達(dá)，下調(diào)p62蛋白表達(dá)，提示黃芪散可能通過(guò)激活PINK1/parkin 通路促進(jìn)線粒體自噬水平。研究表明[24]，ROS是促進(jìn)NLRP3小體活化及其下游IL-1β、IL-18和TNF-α等炎癥分子的表達(dá)的關(guān)鍵信號(hào)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)激活PINK1/parkin通路促進(jìn)線粒體自噬可降低ROS水平，抑制NLRP3炎癥小體活性，減少下游的IL-1β、IL-18等炎癥因子水平，在AD中發(fā)揮保護(hù)作用[25]。本研究結(jié)果表明黃芪散能顯著降低ROS水平，抑制NLRP3炎癥小體活性，并降低炎癥因子IL-1β、IL-18和TNF-α水平，可能與黃芪散激活PINK1/parkin通路促進(jìn)線粒體自噬水平有關(guān)。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)單元，神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元之間通過(guò)突觸緊密聯(lián)系。神經(jīng)元中的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)是神經(jīng)退行性和神經(jīng)保護(hù)的標(biāo)志[26]。神經(jīng)突起生長(zhǎng)是神經(jīng)元發(fā)育，突觸形成和神經(jīng)再生的重要前提。所以促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)和神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的治療顯得尤為重要。BDNF作為一個(gè)重要的神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子，在突觸可塑性、神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)細(xì)胞存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。研究證明激活PINK1/parkin通路促進(jìn)線粒體自噬可改善3xTg-AD小鼠學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知障礙和突觸、樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)及功能損傷[27]。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)黃芪散可升高Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的存活率、增加細(xì)胞突起長(zhǎng)度、提高BDNF蛋白表達(dá)，可能與黃芪散激活PINK1/parkin通路促進(jìn)線粒體自噬有關(guān)。

綜上，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法分析了黃芪散治療AD的作用機(jī)制，得出的結(jié)論是：黃芪散可能是通過(guò)激活PINK1/parkin通路促進(jìn)線粒體自噬清除ROS進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的活化和改善突觸可塑性而發(fā)揮治療AD作用。從分子、細(xì)胞水平進(jìn)行闡述，為深入開(kāi)展黃芪散基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究以及臨床合理應(yīng)用提了供參考。