陳文東，陳耀年，葉文斌，蘇滿春，2

(1. 隴南師范高等專科學(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500 ； 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

灰鶴(Grusgrus)別稱玄鶴、番薯鶴或千歲鶴，其全身灰色，頭頂裸露部分為鮮紅色，被有稀疏的黑色短羽，眼后至后枕有一白色條帶，喉、前頸和后頸為灰黑色?；寅Q是大型遷徙濕地候鳥，屬鶴形目鶴科，體長(zhǎng)100～120 cm，是目前世界上15種鶴類中數(shù)量最多、分布最廣的一種，常棲息于開闊的平原、河灘、湖泊、草地、曠野、沼澤地帶，是雜食性動(dòng)物，常以蛙、昆蟲、蜥蜴、魚類、玉米、谷粒等為食，其中以植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子為主[1-2]。國內(nèi)灰鶴主要分布在北緯32°20′～53°，東經(jīng)76°～135°，垂直分布在海拔65～3 900 m處，包括新疆喀什葉爾羌河流域、甘肅隴南山地和祁連山地、青海柴達(dá)木盆地宗加鄉(xiāng)、寧夏西北部石嘴山和陶樂縣、內(nèi)蒙古大興安嶺、黑龍江嫩江-烏裕爾河水系流域和吉林白城向海保護(hù)區(qū)等[3]。

近年來，家養(yǎng)畜禽感染野生動(dòng)物源細(xì)菌性和病毒性傳染病頻發(fā)，隴南作為灰鶴遷徙過程中的重要駐留地，存在灰鶴源病原菌通過糞便或水源傳染給生態(tài)散養(yǎng)畜禽，引起畜禽傳染病暴發(fā)流行的可能性，因此野生灰鶴是當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)傳染病的重要潛在傳染源。隴南師專狗博士動(dòng)物醫(yī)院在救治隴南機(jī)場(chǎng)防鳥網(wǎng)誤傷的野生灰鶴的過程中，發(fā)現(xiàn)該灰鶴有腹瀉癥狀，本試驗(yàn)以灰鶴泄殖腔內(nèi)細(xì)菌為研究對(duì)象，對(duì)泄殖腔內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定及耐藥性分析，以期為該灰鶴的治療和畜禽養(yǎng)殖防治野生動(dòng)物源傳染病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 隴南機(jī)場(chǎng)防鳥網(wǎng)誤傷腳趾的野生灰鶴，成鳥，雌性，體重4.32 kg，體長(zhǎng)102 cm，全身大部分羽毛呈灰色，頭頂裸露皮膚為鮮紅色，眼后至后枕有一白色條帶，腳呈黑色。

1.2 主要試劑 BGI 2×Super PCR Mix和BGI D2 000 Plus DNA Ladder，均購自武漢華大基因科技有限公司；細(xì)菌基因提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖，購自廈門太陽馬生物工程有限公司；PCR產(chǎn)物磁珠法純化試劑盒，購自上海碩美生物科技有限公司；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基和瑞氏染液，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；pMD19-T載體，購自上海雅吉生物科技有限公司；藥敏紙片，購自常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；測(cè)序儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.4 細(xì)菌分離鑒定 2020年1月12日，無菌采集灰鶴的泄殖腔糞便，置于裝有生理鹽水的離心管內(nèi)充分搖勻，吸取管內(nèi)溶液至普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基各加入100 μL溶液，涂布均勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落至另一培養(yǎng)基上純化，反復(fù)純化3次，將純化后的細(xì)菌進(jìn)行瑞氏染色，顯微鏡觀察。

1.5 生化試驗(yàn) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]的方法，用純化好的細(xì)菌進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、甲基紅(MR)試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)和尿素酶試驗(yàn)，對(duì)細(xì)菌做進(jìn)一步鑒定。

1.6 16S rRNA基因擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 提取分離到的細(xì)菌基因組DNA，以此DNA為模板，用16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：DNA模板1 μL，2×GC Buffer Ⅰ15 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min；96 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收凝膠目的條帶，克隆至pMD19-T載體中，送武漢華大基因科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank中與相關(guān)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行分析。

1.7 藥敏試驗(yàn) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS)推薦的Kirby-Bauer(K-B)法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)定分離菌株對(duì)20種抗菌藥(阿米卡星、頭孢唑林、多黏菌素、四環(huán)素、多西環(huán)素、頭孢哌酮、林可霉素、萬古霉素、頭孢氨芐、米諾環(huán)素、哌拉西林、頭孢曲松、鏈霉素、卡那霉素、青霉素、紅霉素、慶大霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶和氨芐西林)的敏感性，試驗(yàn)結(jié)果的判定按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)(2015年)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 在灰鶴泄殖腔內(nèi)共分離出3株細(xì)菌，分別編號(hào)LNHH1、LNHH2和LNHH3，3株細(xì)菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且均無溶血環(huán)(圖1A～1C)。LNHH1在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為紅色菌落，菌落呈圓形半透明，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊(圖1D)；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上呈紫黑色菌落，菌落有金屬光澤，呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊(圖1E)；瑞氏染色后菌體呈長(zhǎng)短不一的短桿狀，兩端鈍圓，藍(lán)色，散在分布(圖2A)。LNHH2在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落呈圓形，較小的凸起，表面灰白色，光滑濕潤(rùn)(圖1B)；菌體經(jīng)瑞氏染色后呈藍(lán)色，圓形或橢圓形，單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列(圖2B)。LNHH3在鮮血培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落呈較大的圓形凸起，灰白色，表面濕潤(rùn)黏液樣，用接種環(huán)挑取拉成絲狀(圖1C)；經(jīng)瑞氏染色后可見菌體呈較粗的短桿菌，藍(lán)色，單獨(dú)、成對(duì)或聚集存在(圖2C)。

圖1 細(xì)菌分離培養(yǎng)Fig.1 Bacterial isolation and cultureA：LNHH1在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； B：LNHH2在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； C：LNHH3在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；D：LNHH1在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； E：LNHH1在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)A：Colony morphology of LNHH1 on blood medium； B：Colony morphology of LNHH2 on blood medium； C：Colony morphology of LNHH3 on blood medium； D：Colony morphology of LNHH1 on Macconkey medium； E：Colony morphology of LNHH1 on eosin methylene blue medium

圖2 細(xì)菌瑞氏染色(1 000×)Fig.2 Bacterial Wright staining (1 000×)A：LNHH1； B：LNHH2； C：LNHH3

2.2 生化試驗(yàn) 3株細(xì)菌均可以發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖和麥芽糖，LNHH1對(duì)甘露醇、MR試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，硝酸鹽、尿素酶、硫化氫、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽反應(yīng)呈陰性；LNHH2對(duì)硝酸鹽、MR試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，對(duì)甘露醇、尿素酶、硫化氫、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽反應(yīng)呈陰性；LNHH3對(duì)甘露醇、硝酸鹽、尿素酶、V-P試驗(yàn)和檸檬酸鹽反應(yīng)呈陽性，對(duì)MR試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)和硫化氫試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)(表1)。將上述結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》比對(duì)，初步判定LNHH1為大腸埃希菌(Escherichiacoli)，LNHH2為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，LNHH3為肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical test results

2.3 16S rRNA基因擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)樣品均可得到明亮的大小為1 500 bp的電泳條帶(圖3)，符合測(cè)序條件。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果顯示，LNHH1與大腸埃希菌(MH111527.1)親源關(guān)系最近；LNHH2與糞腸球菌(MH135230.1)親源關(guān)系最近；LNHH3與肺炎克雷伯菌(KY494861.1)親源關(guān)系最近(圖4)。結(jié)合生化鑒定結(jié)果，判定LNHH1為大腸埃希菌，LNHH2為糞腸球菌，LNHH3為肺炎克雷伯菌。

2.4 藥敏試驗(yàn) 3株細(xì)菌對(duì)林可霉素和紅霉素均耐藥，LNHH1和LNHH2對(duì)四環(huán)素耐藥，LNHH1和LNHH3對(duì)萬古霉素和青霉素耐藥。此外，菌株LNHH1對(duì)多西環(huán)素耐藥，對(duì)其他14種抗菌藥均敏感；菌株LNHH2對(duì)阿米卡星、多黏菌素、鏈霉素、卡那霉素和慶大霉素耐藥，對(duì)頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢氨芐、頭孢曲松和頭孢他啶中度敏感，對(duì)其他7種抗菌藥敏感；菌株LNHH3對(duì)氨芐西林中度敏感，對(duì)其他15種抗菌藥均敏感(表2)。

圖3 分離菌株16S rRNA序列PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA from the isolated strainsM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：LNHH1； 2：LNHH2； 3：LNHH3M:DNA molecular quality standard; 1:LNHH1; 2:LNHH2; 3:LNHH3

圖4 分離菌株16S rRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree base on 16S rRNA nucleotide sequences of the isolated strains▲:本試驗(yàn)所得分離菌株▲:Strains isolated in this study

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results

3 討論

保護(hù)瀕危、珍貴野生動(dòng)物，對(duì)維持生態(tài)平衡和生物多樣性具有重要意義?；寅Q是國家二級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物，被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ中，有研究報(bào)道，目前在我國分布的灰鶴數(shù)量?jī)H有21 632～22 401只[3]。張偉木等對(duì)草海鶴類主要疫病研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌病為引起野生灰鶴死亡的重要病因之一，其癥狀包括腹瀉、便血以及呼吸困難等[5]。本試驗(yàn)中灰鶴因被隴南機(jī)場(chǎng)防鳥網(wǎng)誤傷，導(dǎo)致機(jī)體免疫力低下，造成體內(nèi)條件性致病菌大量繁殖而致病。為找出導(dǎo)致灰鶴腹瀉的原因，對(duì)腹瀉灰鶴泄殖腔內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)和16S rRNA基因擴(kuò)增鑒定，分離得到3株細(xì)菌，分別為大腸埃希菌、糞腸球菌和肺炎克雷伯菌，均為廣泛存在于動(dòng)物腸道內(nèi)的條件性致病菌[6-8]，在機(jī)體免疫力低下時(shí)，這些存在于機(jī)體腸道內(nèi)的細(xì)菌可成為致病菌，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重威脅[9]。已有研究證實(shí)，大腸埃希菌正常情況下主要分布在人和動(dòng)物的呼吸道、消化道和泌尿系統(tǒng)內(nèi)，在機(jī)體免疫力低下時(shí)可以引起人和動(dòng)物發(fā)生胃腸道或尿道等多種局部組織器官感染[10-11]。糞腸球菌主要分布在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)所和畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)加工的環(huán)境中，或存在于人和動(dòng)物上呼吸道、消化道和生殖道內(nèi)，另外還廣泛分布在自然界中[12-13]，可引起牛、羊、豬、雞、鴕鳥和蜜蜂等多種動(dòng)物發(fā)病[14-15]。肺炎克雷伯菌具備躲避宿主免疫系統(tǒng)的能力，且菌毛為其提供吸附寄存條件，因此大多數(shù)肺炎克雷伯菌具備潛在致病力[16]，雞、鴨、豬、羊、貓和獺兔等畜禽可感染肺炎克雷伯菌而致病[17]。灰鶴在遷徙過程中會(huì)停歇在河流或農(nóng)田等地，其糞便會(huì)污染這些棲息地，從而使當(dāng)?shù)丶茵B(yǎng)畜禽感染。

3株細(xì)菌生化試驗(yàn)的反應(yīng)特性與從其他家養(yǎng)動(dòng)物分離鑒定的同種細(xì)菌生化特性均有不同[18-20]，表明野生動(dòng)物源細(xì)菌鑒定可將生化試驗(yàn)作為參考，準(zhǔn)確鑒定仍需進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序。

目前臨床上主要通過抗生素治療細(xì)菌性疾病，隨之導(dǎo)致的細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性問題，已在世界范圍內(nèi)引起高度重視[21]。夏倫斌等對(duì)雛雞源致病性糞腸球菌進(jìn)行耐藥性分析，并利用分析結(jié)果進(jìn)行治療，結(jié)果雞群病情得到控制[22]。本試驗(yàn)為對(duì)腹瀉灰鶴精準(zhǔn)治療，避免產(chǎn)生耐藥性問題，進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)腹瀉灰鶴進(jìn)行臨床治療，取得了較好效果。同時(shí)，甘肅隴南地處秦巴山區(qū)、黃土高原、青藏高原的交匯區(qū)域，為長(zhǎng)江流域和亞熱帶氣候地區(qū)，每年該地區(qū)有大量遷徙灰鶴經(jīng)過，其糞便可能會(huì)落入養(yǎng)殖場(chǎng)或通過水源與畜禽間接接觸。調(diào)查灰鶴源菌株耐藥情況，對(duì)當(dāng)?shù)匦笄蒺B(yǎng)殖防治野生動(dòng)物源傳染病也具有重要意義。