韓婧娥，李 曉，趙文鵬，高 健，秦順義

(1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 西青 300392 ；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193 ； 3.上海瑞鵬寵物醫(yī)院有限公司，上海 崇明201914)

沙門菌(Salmonella)是無芽孢的革蘭陰性桿菌，屬于人獸共患病原菌，其感染能力較強(qiáng)，畜禽感染可引起仔豬霍亂、雞白痢和犬腸胃炎等[1-3]，同時(shí)其也能引起人類食源性感染并引發(fā)食物中毒[4-5]，在世界范圍內(nèi)，每年都有人類因感染沙門菌而導(dǎo)致死亡的病例[6-7]。近年來，隨著寵物犬?dāng)?shù)量的增加，由沙門菌感染引起寵物犬腹瀉的病例也逐漸增加[3]；使用抗菌藥物是當(dāng)前治療犬沙門菌感染的主要手段，但由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致犬沙門菌耐藥性問題日益嚴(yán)重。關(guān)于上海地區(qū)寵物犬沙門菌致腹瀉的情況及其耐藥性的研究較為罕見。本試驗(yàn)采集上海市部分寵物醫(yī)院206份犬腹瀉肛門拭子樣品，進(jìn)行沙門菌的分離、培養(yǎng)、鑒定和耐藥性檢測，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2018年5月—2020年8月，在上海瑞鵬寵物醫(yī)院有限公司下屬的各寵物醫(yī)院采集的腹瀉寵物犬肛門拭子206份。質(zhì)控菌株：沙門菌ATCC14028菌株，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 犬肛門拭子樣品的采集 將采樣棉拭子插入患犬肛門內(nèi)，取樣后將棉拭子插入采樣管中封口，置于4oC保存用于后續(xù)沙門菌的分離。

1.2.2 病原菌的分離和純化 將一次性接種環(huán)、沙門菌志賀菌瓊脂培養(yǎng)基(Salmonella-Shigella agar,SS)平板、溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基(Luria-Bertani agar,LB)平板、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MacConkey agar,MAC)平板和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(Tryptic soy agar,TSA)平板置于超凈工作臺，紫外照射15 min，用棉簽蘸取適量的樣品液，在平板上劃線接種，將接種的平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)14 h。從培養(yǎng)箱取出平板并置于超凈工作臺內(nèi)，用接種環(huán)挑取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，過夜振蕩培養(yǎng)；另挑取單菌落用四區(qū)劃線法分別接種于SS平板、MAC平板和TSA平板，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置過夜培養(yǎng)。

1.2.3 分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察 使用南京建成生物工程研究所提供的革蘭染液對細(xì)菌進(jìn)行染色，然后于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 分離菌株的生化鑒定 篩選與沙門菌的菌落形態(tài)特征相符合且鏡檢結(jié)果為革蘭陰性的菌株，接種于腸桿菌微量生化發(fā)酵管內(nèi)進(jìn)行生化鑒定，37 ℃培養(yǎng)14 h后參照生化鑒定管中腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定說明書，對分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.2.5 分離菌株的分子鑒定 (1)細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸 (Deoxyribonucleic acid,DNA)提取及引物設(shè)計(jì)合成：將細(xì)菌過夜培養(yǎng)14 h，吸取1 mL菌液，12 000 r/min條件下離心3 min，棄上清液，常規(guī)提取細(xì)菌基因組DNA。設(shè)計(jì)合成16S核糖體脫氧核糖核酸(16S ribosomal deoxyribonucleic acid，16S rDNA)基因引物：上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，對分離菌株進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行測序分析。同時(shí)，設(shè)計(jì)合成沙門菌特異性基因invA引物[8]，上游引物：5′-AGTGCCGGTTTTATCGTGAC-3′；下游引物：5′-CTCGCCTTTGCTGGTTTTAG-3′，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。(2)反應(yīng)體系(20 μL)：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，無酶水7 μL，混勻之后，瞬時(shí)離心備用。(3)反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；運(yùn)行完后，將樣品4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 分離菌株的藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯法測定不同抗菌藥對沙門菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)。將滅菌后的96孔板中每孔加入100 μL水解酪蛋白肉湯(Mueller-hinton broth，MHB)培養(yǎng)基；在96孔板中由上到下依次加入13種抗菌藥100 μL，最后2排分別作為陰性和陽性對照，使用排槍將抗菌藥進(jìn)行2倍倍比稀釋，把最后一孔的100 μL藥液棄去；在上述加過藥液的96孔板中加入稀釋好的菌液100 μL，從左至右依次加入。之后將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長，以無細(xì)菌生長的最低稀釋濃度作為檢測抗菌藥對沙門菌的MIC；試驗(yàn)中能抑制50%和90%受試菌生長的濃度即為MIC50和MIC90。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察 部分分離菌株在含有脫纖維綿羊血TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，菌落形態(tài)呈現(xiàn)出圓形、表面濕潤的特征(圖1A)；在LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，菌落呈現(xiàn)出圓潤、光滑的形態(tài)(圖1B)；在SS和MAC培養(yǎng)基上培養(yǎng)后生長為白色、透明、圓潤的菌落(圖1C、1D)，與沙門菌的菌落形態(tài)特征相符合。將與沙門菌的菌落形態(tài)特征相符合的菌株進(jìn)行革蘭染色，發(fā)現(xiàn)部分菌株經(jīng)革蘭染色呈現(xiàn)紅色，菌體形態(tài)為單個(gè)或短鏈狀排列的桿狀或短棒狀(圖2)，屬于革蘭陰性桿菌。染色鏡檢后，在206份樣品中共獲得12株形態(tài)學(xué)特征與沙門菌相符的革蘭陰性桿菌菌株，將這12株菌株繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 分離菌株培養(yǎng)特性Fig.1 Culture characteristics of isolated strainsA：分離菌株在TSA-綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)特征； B：分離菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)特征； C：分離菌株在SS瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)特征； D：分離菌株在MAC瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)特征A:Morphological characteristics of isolated strains on TSA sheep blood agar medium; B:Morphological characteristics of isolated strains on LB agar medium; C:Morphological characteristics of isolated strains on SS agar medium; D:Morphological characteristics of isolated strains on MAC agar medium

圖2 分離菌株革蘭染色鏡檢(100×)Fig.2 Gram staining microscopy of isolated strains (100×)

2.2 分離菌株的生化鑒定 分離菌株在葡萄糖、賴氨酸、硫化氫、衛(wèi)茅醇和枸櫞酸鹽生化鑒定管中均呈陽性；在鳥氨酸、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和尿素生化鑒定管中均呈陰性(表1)。將以上生化鑒定結(jié)果與腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定說明書比對可知，該分離菌株生化鑒定結(jié)果符合沙門菌生化特征。

表1 分離菌株生化鑒定Table 1 Biochemical identification of isolated strains

2.3 分離菌株的分子鑒定 提取分離菌株DNA后，對16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，分離菌株16S rDNA基因PCR產(chǎn)物電泳條帶的大小一致，且與沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組條帶大小一致，約為750 bp(圖3)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行16S rDNA測序后經(jīng)比對分析，確定所分離的菌株為沙門菌。

提取分離菌株DNA后，對沙門菌特異性基因invA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示，分離菌株特異性基因invAPCR產(chǎn)物電泳條帶的大小一致，且與沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株特異性基因invA基因大小一致，約為249 bp(圖4)。

圖4 分離菌株invA基因的PCR擴(kuò)增Fig.4 PCR amplification of invA gene of isolated strains M：DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； N：陰性對照； 1～12：各分離菌株invA基因片段； 13：陽性對照M:DL-2 000 DNA Marker; N:Negative control; 1-12:invA gene fragments of each isolated strain; 13:Positive control

2.4 分離菌株的藥敏試驗(yàn) 對分離菌株的耐藥性進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，檢測藥物MIC范圍在0.06～128 μg/mL;分離的沙門菌菌株對不同的藥物具有一定的耐藥性，各種藥物的MIC值分布為：頭孢氨芐4～64 μg/mL，頭孢曲松0.06～1 μg/mL，頭孢噻呋0.25～2 μg/mL，頭孢噻肟0.06～1 μg/mL，卡那霉素8～128 μg/mL，慶大霉素1～128 μg/mL，亞胺培南0.5～16 μg/mL，阿莫西林/克拉維酸16～128 μg/mL，恩諾沙星0.06～4 μg/mL，多黏菌素B 0.125～16 μg/mL，四環(huán)素4～128 μg/mL。

對分離菌株的MIC結(jié)果分析可知，分離的沙門菌菌株對阿莫西林/克拉維酸的耐藥性最高，耐藥率為100%；其次是頭孢氨芐，耐藥率達(dá)到83.3%；對四環(huán)素、慶大霉素和亞胺培南的耐藥率分別為41.7%、41.7%和33.3%；對卡那霉素、多黏菌素B和恩諾沙星的耐藥率分別為16.7%、8.3%和8.3%；對頭孢曲松、頭孢噻呋和頭孢噻肟均敏感(表2)。

表2 分離菌株MIC檢測Table 2 MIC detection of isolated strains

續(xù)表

3 討論

腹瀉是寵物犬的常見病和多發(fā)病，其致病因素較多，近年來，隨著寵物行業(yè)診療水平的提升，由沙門菌感染引起的寵物犬腹瀉的報(bào)道也逐漸增加[3,8-9]；但上海地區(qū)沙門菌感染導(dǎo)致的寵物犬腹瀉的病例和流行病學(xué)報(bào)道較少。本試驗(yàn)從采集的206份腹瀉犬肛門拭子樣品中分離得到12株疑似沙門菌，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定和16S rDNA、沙門菌invA特異性基因PCR擴(kuò)增鑒定，最終確定分離的疑似菌株為沙門菌。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，上海地區(qū)沙門菌感染導(dǎo)致寵物犬腹瀉的比例為5.83%(12/206)，而其他地區(qū)沙門菌感染導(dǎo)致寵物犬腹瀉的相關(guān)數(shù)據(jù)罕見報(bào)道；僅有部分地區(qū)寵物犬沙門菌攜帶率的相關(guān)報(bào)道，如合肥市寵物犬沙門菌的攜帶率為2.55%(19/746)[10]，洛陽地區(qū)寵物犬沙門菌的攜帶率為17.5%(21/120)[11]，烏魯木齊地區(qū)寵物(犬和貓)沙門菌的攜帶率則高達(dá)32.2% (99/307)[12]。依據(jù)上海地區(qū)沙門菌感染導(dǎo)致寵物犬腹瀉的比例較低，推測上海地區(qū)犬沙門菌的攜帶率可能也處于較低水平。

目前，感染沙門菌后主要采用抗菌藥進(jìn)行治療，然而抗菌藥的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致耐藥沙門菌的數(shù)量迅速增加[8-9,13]。據(jù)報(bào)道，沙門菌對氟喹諾酮類和第3代頭孢菌素等臨床重要抗菌藥物的耐藥率正在逐年上升[14]。由于沙門菌在表型和遺傳上的耐藥性也各不相同，并受人和動物使用的抗菌藥物種類的影響，造成沙門菌的耐藥水平也不盡相同。因此，對犬沙門菌耐藥性進(jìn)行研究可為臨床上治療該菌引發(fā)的犬腸炎性腹瀉提供重要參考。本試驗(yàn)通過對上海地區(qū)分離的寵物犬沙門菌的耐藥性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)寵物犬沙門菌的耐藥問題比較嚴(yán)重。本試驗(yàn)分離的沙門菌對阿莫西林/克拉維酸完全耐藥，對頭孢氨芐的耐藥率達(dá)到83.3%，對四環(huán)素、慶大霉素和亞胺培南的耐藥率分別為41.7%、41.7%和33.3%，但是對第3代抗菌藥頭孢曲松、頭孢噻呋和頭孢噻肟均敏感。本試驗(yàn)結(jié)果與河南洛陽地區(qū)寵物犬沙門菌的耐藥性研究結(jié)果[3]相比，兩者對頭孢氨芐、慶大霉素和恩諾沙星的耐藥率相似，但對頭孢曲松和頭孢噻肟的耐藥率相差較大。兩者之間沙門菌耐藥率的不同可能與所分離樣本的地域有密切關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果可為上海地區(qū)寵物犬感染沙門菌的臨床治療提供用藥指導(dǎo)。