邱 芳，侯思?jí)?，李芳娥，顧慶云，郭晶晶，劉連杰，周祥玲，劉曉強(qiáng)

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100 ； 2. 陜西省富平縣畜牧獸醫(yī)局，陜西 富平 711700 ；3. 西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏 拉薩 850030 ； 4. 甘肅武山縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，甘肅 武山 741300)

乳房炎是泌乳動(dòng)物常見(jiàn)的疾病之一，在奶山羊養(yǎng)殖中較為常見(jiàn)，其發(fā)病率高、防治困難，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。葡萄球菌是引起奶山羊乳房炎的常見(jiàn)菌[3]，以金黃色葡萄球菌最為常見(jiàn)，其也是重要的人獸共患病病原微生物，且極易耐藥，一旦感染很難徹底治療，對(duì)公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅。藏藥在我國(guó)已有幾千年的歷史，是一種古老的民族藥，流傳至今，對(duì)人類健康有不可磨滅的貢獻(xiàn)[4-7]。

近年研究表明，很多藏藥具有良好的抗菌活性，逐漸成為“替抗”研究的熱點(diǎn)。短穂兔耳草是常用的藏藥，全草入藥可用于治療全身發(fā)燒、腎炎、肺病、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等[8]；藥理試驗(yàn)證明，其具有體外抑菌、抗炎、降血糖和抗腫瘤等功效[9]。獐牙菜根入藥能去肝火[10]。鉤藤莖枝入藥可降血壓。鐵棒錘塊根可用于治療跌打損傷、骨折、風(fēng)濕腰痛、凍瘡等癥。甘青青蘭具有平肝、利膽等功效，常用于治療肝炎、膽囊炎、流感、胃炎等疾病。近年來(lái)，也有文獻(xiàn)報(bào)道了上述藥物的抗菌活性[11-15]。本試驗(yàn)旨在測(cè)定短穂兔耳草、甘青青蘭、烏奴龍膽、鐵棒錘、鉤藤和獐牙菜此6種藏藥對(duì)奶山羊乳房炎分離的葡萄球菌的體外抑菌活性，為綜合開(kāi)發(fā)藏藥治療奶山羊乳房炎提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 獐牙菜、烏奴龍膽、鉤藤、鐵棒錘、甘青青蘭(唐古特青蘭)和短穂兔耳草，均購(gòu)自西藏自治區(qū)拉薩市雪域大藥房；青霉素、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢噻呋、阿米卡星、克林霉素、環(huán)丙沙星、泰萬(wàn)菌素和多西環(huán)素，均購(gòu)自大連美倫生物科技有限公司；酵母粉、胰蛋白胨，均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；瓊脂粉，購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司；MH培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭染色液，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；2×TaqPCR Master Mix，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物合成和測(cè)序分析由北京奧科鼎盛生物公司完成。

1.2 主要儀器設(shè)備 液體加熱器，廣東潮安金石鎮(zhèn)柏源五金制品廠產(chǎn)品；臺(tái)式低速離心機(jī)TDZ5，湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品；FA1204B電子天平，上海天美天平儀器有限公司產(chǎn)品；微生物培養(yǎng)箱DHP-9051，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 奶樣采集 2020年4—6月從陜西省渭南市富平縣3個(gè)奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)采集診斷為強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性和隱性乳房炎的羊的乳樣品。采集奶樣前需先用溫水清洗采樣乳頭，再用碘酒消毒乳頭，并在清洗或消毒乳頭后均用消毒毛巾擦干。棄去采樣乳區(qū)的頭3把乳，然后采集乳樣5～8 mL，擠入滅菌離心管，并做好標(biāo)記，于冰浴中送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定。采樣前患羊均未接受藥物治療。

1.4 細(xì)菌的分離鑒定 搖勻乳樣，劃線接種于5%犢牛血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h后，取形態(tài)和溶血環(huán)不同的單個(gè)菌落繼續(xù)劃線接種于LB固體培養(yǎng)基、高鹽甘露醇固體培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)，并選取不同形態(tài)單菌落涂片、革蘭染色鏡檢。同時(shí)，對(duì)各菌落進(jìn)行生化鑒定和16S rRNA擴(kuò)增、測(cè)序。

1.5 藥液的制備 分別稱取短穂兔耳草、鐵棒錘、鉤藤、烏奴龍膽、甘青青蘭和獐牙菜各20 g，剪碎后放入煎藥砂鍋，加入10倍量蒸餾水，室溫浸泡過(guò)夜后煎煮1 h，用4層折疊的紗布過(guò)濾，收集濾液。再加入適量蒸餾水，按上述方法煎煮、過(guò)濾，重復(fù)3次。將3次的濾液合并，加熱濃縮至50 mL，4 000 r/min離心5 min，取上清液置于50 mL燒杯中，進(jìn)一步加熱濃縮至20 mL，得到濃度為1 g/mL的藏藥水提取物原液，紫外線照射 30 min 滅菌，4℃保存?zhèn)溆?。抗菌藥物按照美?guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的方法配制為1 280 μg/mL的藥液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 葡萄球菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用CLSI推薦的微量稀釋法測(cè)定分離的葡萄球菌對(duì)青霉素、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢噻呋、阿米卡星、克林霉素、環(huán)丙沙星、泰萬(wàn)菌素和多西環(huán)素這9種(7類)抗菌藥物的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)。以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923為質(zhì)控菌株。參考CLSI[16]和歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST)[17]中相關(guān)菌種和藥物的標(biāo)準(zhǔn)，判定耐藥折點(diǎn)敏感(Sensitive, S)、中介(Intermediate, I)和耐藥(Resistant, R)。由于對(duì)除金黃色葡萄球菌之外的其他葡萄球菌在獸醫(yī)臨床的耐藥折點(diǎn)尚無(wú)判定標(biāo)準(zhǔn)，所以本試驗(yàn)中主要參考金黃色葡萄球菌的耐藥折點(diǎn)進(jìn)行判定。

1.7 藏藥水提取物的體外抑菌活性 采用紙片瓊脂擴(kuò)散(K-B)法測(cè)量抑菌圈直徑。將滅菌的空白濾紙圓片(直徑 6 mm)放入含生藥濃度為1 g/mL 的藏藥水提取物中浸泡12 h，待圓片飽和以后用無(wú)菌鑷子取出，置于烘箱烘干備用。以金銀花作為陽(yáng)性對(duì)照。

將菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫韧坎加贛H培養(yǎng)板，將制備的藏藥紙片貼于 MH 平板上，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h后測(cè)量抑菌圈直徑，每株細(xì)菌重復(fù)3次。藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>16 mm 為高度敏感，11～15 mm 為中度敏感，≤10 mm 為輕度敏感或不敏感。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離和鑒定 從55份乳樣中共分離得到52種細(xì)菌，共計(jì)149株。其中葡萄球菌56株(37.58%)、腸桿菌60株(40.27%)、芽孢桿菌11株(7.38%)、腸球菌2株(1.34%)，其他菌株20株(13.43%)。56株葡萄球菌中包括金黃色葡萄球菌27株、溶血性葡萄球菌10株、表皮葡萄球菌6株、腐生葡萄球菌5株、雞葡萄球菌4株，此外，加利鈉葡萄球菌、科尼葡萄球菌、模仿葡萄球菌、馬葡萄球菌各1株。

2.2 葡萄球菌藥物敏感性試驗(yàn) 本試驗(yàn)所選的9種抗菌藥物對(duì)56株葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。受試的葡萄球菌對(duì)青霉素、阿莫西林和頭孢曲松100%耐藥；金黃色葡萄球菌和溶血性葡萄球菌對(duì)阿米卡星、泰萬(wàn)菌素和多西環(huán)素較為敏感；表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌和雞葡萄球菌對(duì)阿米卡星和泰萬(wàn)菌素的耐藥率介于25.0%～50.0%，對(duì)其余受試藥物的耐藥率達(dá)50.0%～100%，且以多重耐藥菌居多；科尼葡萄球菌和模仿葡萄球菌對(duì)9種受試藥物均耐藥，加利鈉葡萄球菌對(duì)阿米卡星和多西環(huán)素敏感，對(duì)其他受試藥物均耐藥；馬葡萄球菌對(duì)阿米卡星和泰萬(wàn)菌素敏感，對(duì)其他受試藥物均耐藥。

2.3 藏藥水提取物的體外抑菌活性 采用K-B法測(cè)定了6種藏藥水提物對(duì)所分離的葡萄球菌的體外抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)圖 1 和表 2，6種藏藥水提物對(duì)各類葡萄球菌均具有不同程度的抑制作用，抑菌圈直徑范圍為7.30～25.50 mm。根據(jù)藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)及每株受試菌的抑菌圈直徑，短穂兔耳草的抗菌作用最強(qiáng)，所有受試的葡萄球菌均對(duì)其高度敏感；其次為鐵棒錘，89.3%(50/56)的受試葡萄球菌對(duì)其高度敏感；分別有91.1%(51/56)、89.3%(50/56)、83.9%(47/56)的受試葡萄菌株對(duì)鉤藤、獐牙菜和甘青青蘭中度敏感；87.5%(49/56)受試菌對(duì)烏奴龍膽輕度敏感或不敏感。6種藥物的抗菌活性依次為短穂兔耳草>鐵棒錘>鉤藤>獐牙菜>甘青青蘭>烏奴龍膽。

圖1 6種藏藥對(duì)部分葡萄球菌的體外抑菌試驗(yàn)Fig.1 In vitro antimicrobial test of six Tibetan medicinal plants against some Staphylococcus isolatesA:溶血性葡萄球菌； B:表皮葡萄球菌； C:金黃色葡萄球菌A:S. haemolyticus; B:S. epidermidis; C:S. aureus

3 討論

本試驗(yàn)從55份奶山羊乳房炎奶樣中分離得到52種細(xì)菌，共149株，其中葡萄球菌56株，占37.58%。金黃色葡萄球菌為主要致病菌，這與國(guó)內(nèi)外許多關(guān)于奶山羊乳房炎致病菌的報(bào)道相似[18-20]。目前，臨床對(duì)于奶山羊乳房炎的治療主要以抗菌藥物為主，抗菌藥物的使用容易導(dǎo)致病原菌耐藥性的出現(xiàn)和蔓延，特別是多重耐藥菌的增多。因此，防控奶山羊乳房炎不應(yīng)頻繁過(guò)量使用同一種或同一類抗菌藥物[21]。另外，羊舍的環(huán)境保障也是關(guān)鍵，要做到衛(wèi)生整潔、消毒徹底、科學(xué)擠奶、合理干奶以及完善管理等。

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，所分離的葡萄球菌對(duì)青霉素、阿莫西林和頭孢曲松的耐藥率均達(dá)到100%，對(duì)其他6種受試的抗菌藥物也具有不同程度的耐藥性；加利鈉葡萄球菌對(duì)除阿米卡星和多西環(huán)素之外的其他受試藥物均耐藥；馬葡萄球菌對(duì)除阿米卡星和泰萬(wàn)菌素之外的其他受試藥物均耐藥；科尼葡萄球菌和模仿葡萄球菌則對(duì)所有受試的抗菌藥物均耐藥(表1)，但是所有分離的葡萄球菌對(duì)除烏奴龍膽之外的其他5種受試藏藥普遍具有敏感性(表2)。短穂兔耳草和鐵棒錘對(duì)致奶山羊乳房炎的葡萄球菌的抗菌活性最明顯，鉤藤、獐牙菜和甘青青蘭對(duì)所受試菌株也表現(xiàn)出較好的抑菌效果，烏奴龍膽則未表現(xiàn)出明顯的抑菌活性?；诒驹囼?yàn)結(jié)果，初步篩選出對(duì)包括多重耐藥菌在內(nèi)的葡萄球菌有顯著抑制活性的藏藥，為后續(xù)進(jìn)一步研究其對(duì)奶山羊乳房炎的治療作用和新型抗耐藥菌天然藥物的開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。目前，單味藏藥抑菌研究主要集中于清熱解毒類藏藥對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑菌作用[22]。2003年，蔣丹等[23]研究了包括龍膽草在內(nèi)的22種中草藥醇提物對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的敏感性，結(jié)果表明，龍膽草對(duì)3種細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑菌活性，其MICs分別為2.50、2.50 g/mL和1.25 g/mL。2005年，張春江[24]研究了甘肅甘南采集的異葉青蘭、甘青烏頭、烏奴龍膽、五脈綠絨蒿、獐牙菜、蒺藜、兔耳草提取物對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等細(xì)菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)藏藥對(duì)所選菌種均有一定抑制作用，其中異葉青蘭和甘青烏頭抑菌活性最強(qiáng)。2006年，靳涵[25]研究了唐古特青蘭水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的抗菌活性，結(jié)果顯示，唐古特青蘭對(duì)受試菌株均有不同程度的抑菌活性。2014年，胡君茹等[26]用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定甘青青蘭水和乙醇提取物的抑菌活性，結(jié)果顯示，兩者對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有確切的抑菌作用。2015年，董開(kāi)忠等[27]研究了鐵棒錘不同提取物的抑菌活性，結(jié)果顯示，鐵棒錘具有廣譜抗菌作用，且對(duì)以大腸埃希菌為代表的革蘭陰性菌的抑菌活性更顯著。2019年，王曉玲等[28]的研究結(jié)果表明龍膽燥濕栓提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鏈球菌具有較好的抑制作用。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，短穂兔耳草、鐵棒錘、鉤藤、甘青青蘭和獐牙菜對(duì)致奶山羊乳房炎葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最好，對(duì)耐藥菌也有較好的抑制效果，這為解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題提供了研究基礎(chǔ)。本試驗(yàn)為青藏高原藏藥資源的開(kāi)發(fā)和研究起到積極的推動(dòng)作用，并對(duì)綜合開(kāi)發(fā)利用藏藥治療奶山羊乳房炎具有重要的探索價(jià)值。