李虹瑾，唐玉嬌，劉嘉琳，劉 斌，董文龍

(1.長春科技學(xué)院職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130600 ； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118 ； 3.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 吉林 132109)

寵物犬作為人類忠實的伙伴，已成為很多家庭的伴侶動物。然而，由于犬只本身免疫低下或是寵主的不科學(xué)喂養(yǎng)，常導(dǎo)致寵物犬感染致病性細菌而發(fā)病。本試驗在1只患有外耳炎的金毛犬耳道拭子樣品中分離到1種凝固酶陰性葡萄球菌，并對分離菌株進行了鑒定和藥物敏感性分析。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 無菌采集金毛犬外耳炎膿液樣品，進行致病性細菌的分離鑒定。

1.2 主要試劑 Mueller-Hinton瓊脂、腦心浸液瓊脂、腦心浸液肉湯、細菌生化鑒定管和兔血漿，均購自青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、革蘭染色液，均購自北京索萊寶科技有限公司；DL2 000 DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司；TaqPCR Mix 預(yù)混液、瓊脂糖、無菌去離子水、50×TAE 緩沖液、溴化乙錠(EB)，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 試驗藥品 環(huán)丙沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、阿奇霉素、紅霉素、林可霉素、克林霉素、頭孢噻肟、氯霉素、慶大霉素、萬古霉素、阿莫西林和磺胺間甲氧嘧啶共14種抗菌藥物，均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院饋贈。

1.4 細菌的分離培養(yǎng) 將采集的膿液樣品接種于腦心浸液瓊脂平板上，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h，挑取單菌落于腦心浸液肉湯中搖床增殖培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。取100 mL菌液進行1 000倍稀釋后涂布于腦心浸液瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察菌落形態(tài)。

1.5 革蘭染色鏡檢 清潔載玻片表面，采用無菌生理鹽水稀釋挑取的單菌落，酒精燈火焰上進行加熱固定，按步驟進行革蘭染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)特征。

1.6 生化試驗 在兔血漿安瓿瓶中加入腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基0.2 mL，再加入制備的濃菌懸液 0.5 mL，(36±1) ℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察6 h，根據(jù)是否有凝塊形成判定分離菌株是否能夠產(chǎn)生血漿凝固酶。備用的培養(yǎng)菌液分別接種于葡萄糖、乳糖、甘露醇等發(fā)酵管中進行產(chǎn)酸生化試驗。

1.7 16S rRNA基因序列分析 抽取1 mL備用菌液10 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，作為分離菌株16S rRNA基因PCR擴增的模板。參照參考文獻[1]設(shè)計16S rRNA細菌鑒定通用引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：基因組DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，TaqPCR Mix 預(yù)混液12 μL，無菌去離子水10 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，對1 500 bp處目的條帶進行切膠回收，送生工生物工程(長春)股份有限公司測序，將一代測序獲得的基因序列進行BLAST比對分析。

1.8 系統(tǒng)進化分析 于GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與分離菌株16S rRNA基因序列高度同源的16S rRNA基因序列，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.9 最小抑菌濃度(Mininum inhibitory concentration，MIC)測定及藥敏試驗 將菌液調(diào)整至濃度為1×106CFU/mL，抗菌藥物配制成0.030、0.060、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000、128.000、256.000 μg/mL和512.000 μg/mL 15個不同的梯度濃度，采用瓊脂擴散法測定14種抗菌藥物對分離菌株的MIC。藥敏結(jié)果的判讀參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)抗微生物藥物敏感性試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離培養(yǎng) 分離菌株命名為SP-1，涂布于腦心浸液瓊脂平板上培養(yǎng)后，可見乳白色較小菌落，邊緣整齊，表面光滑，略凸起(圖1)。

圖1 SP-1菌落形態(tài)Fig.1 SP-1 colony morphology

2.2 革蘭染色鏡檢 油鏡下觀察可見明顯的革蘭陽性葡萄球菌，多數(shù)菌體呈聚集狀態(tài)(圖2)。

圖2 SP-1革蘭染色結(jié)果(1 000×)Fig.2 Result of SP-1 Gram staining (1 000×)

2.3 生化試驗 分離菌株SP-1不能產(chǎn)生血漿凝固酶，其他各項生化試驗結(jié)果與 Trülzsch等[2]相關(guān)試驗中皮氏葡萄球菌的生化結(jié)果基本一致(表1)。

表1 SP-1生化試驗結(jié)果Table 1 Results of SP-1 biochemical test

2.4 16S rRNA基因序列分析 分離菌株16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1 500 bp處有一清晰核酸電泳條帶(圖3)。PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果(1 461 bp)與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)菌株序列進行比對，結(jié)果顯示，SP-1與皮氏葡萄球菌的同源性為99%。

圖3 分離株16S rRNA的 PCR 擴增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA of the isolateM：DL2 000 DNA Marker； 1：SP-1 16S rRNA 基因PCR擴增產(chǎn)物M:DL2 000 Marker; 1:PCR product of SP-1 16S rRNA

2.5 系統(tǒng)進化分析 選取SP-1 16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中其他來源皮氏葡萄球菌的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，SP-1與其他來源的皮氏葡萄球菌親緣關(guān)系均較遠(圖4)。

圖4 SP-1 與其他來源皮氏葡萄球菌16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建Fig.4 Construction of phylogenetic tree of 16S rRNA gene from SP-1 and other Staphylococcus pettenkoferi▲:本試驗所得分離株▲：The strain isolated in this experiment

2.6 MIC測定及藥敏試驗 采用瓊脂擴散法測定14種抗菌藥物對SP-1的MIC值，藥物敏感性結(jié)果顯示，SP-1對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、頭孢噻肟、慶大霉素、萬古霉素和阿莫西林敏感，對林可霉素、克林霉素、阿奇霉素、紅霉素和磺胺間甲氧嘧啶高度耐藥(表2)。

3 討論

凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococci，CoNS)被認為是構(gòu)成人類和動物皮膚及黏膜正常微生物群的主要組成部分，一般無致病作用，與臨床感染關(guān)聯(lián)并不密切。然而，近年來大量臨床數(shù)據(jù)表明，這些凝固酶陰性葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌可引起免疫缺陷患者或新生兒不同形式的感染，如細菌性腦膜炎、鼻炎、鼻息肉、鼻竇炎、壞死性鼻竇炎、假體周圍關(guān)節(jié)感染、咽炎、頭頸骨髓炎、扁桃體炎、復(fù)發(fā)性扁桃體炎等[3-4]。此外，在獸醫(yī)臨床上具有致病性的凝固酶陰性葡萄球菌的分離率也在逐漸增多，該類細菌可引起奶牛的乳房炎、豬的呼吸系統(tǒng)疾病、貓的尿路感染和外耳炎等[5-7]。

表2 SP-1藥敏試驗結(jié)果Table 2 Results of SP-1 drug sensitivity test

皮氏葡萄球菌于2002年被鑒定為一種新的血漿凝固酶陰性葡萄球菌，該細菌是人類皮膚的共生細菌[2]。與其他血漿凝固酶陰性葡萄球菌類似，皮氏葡萄球菌很少具有致病性，但偶爾也會在免疫系統(tǒng)受損的患者中引起感染[8]。近年來，德國、比利時、法國、韓國、意大利、巴西和墨西哥等國家相繼報道由皮氏葡萄球菌造成感染的病例，其中多數(shù)病例都是從人體血液中分離到該病原[9-10]。

2018年，印度學(xué)者首次從1只患有腹膜炎的貓體內(nèi)分離到皮氏葡萄球菌，分離株對包括甲氧西林在內(nèi)的36種抗菌藥物耐藥，分離株不能形成生物膜，但攜帶多個生物膜生成基因(icaA、IS257、nuc和mecA)[11]。本試驗從患有外耳炎的金毛犬耳道膿液樣品中分離到1株皮氏葡萄球菌，該菌株對林可霉素、克林霉素、阿奇霉素、紅霉素和磺胺間甲氧嘧啶表現(xiàn)出高度耐藥。因此，需要警惕該菌成為耐藥基因的貯存庫，通過人與寵物間的親密接觸，使耐藥基因在對人類危害較大的致病菌中水平傳播。目前，由血漿凝固酶陰性葡萄球菌引起的院內(nèi)感染病例正在逐年增加，其中耐藥性葡萄球菌給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)[3-4]。因此有必要對皮氏葡萄球菌的致病機制和耐藥機制進行深入的研究，防范該細菌對人類和動物可能造成的潛在危害。