殷 雷 齊 燕 黨相國(guó) 孫喜波 苗 鑫 胡瀟方 李湘奇▲

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院乳腺外科，山東泰安 271000；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)室，山東泰安 271000

乳腺癌現(xiàn)已成為威脅女性健康的主要疾病。近年來，發(fā)病年齡逐漸年輕化，發(fā)病率亦不斷上升。據(jù)2020年的全球癌癥統(tǒng)計(jì)，女性乳腺癌的發(fā)病率已超過肺癌成為最常見的癌癥，高達(dá)226萬例新增病例，占癌癥患者總數(shù)的11.7%[1-2]。2020年，在我國(guó)最常見的癌癥中，乳腺癌取代了肝癌排名第四，也成為中國(guó)女性中最常見的癌癥類型，新增病例數(shù)量從2015年的30萬增加到2020年的42萬，占全球乳腺癌的18%[3]。乳腺癌的靶向治療開啟了乳腺癌治療的新方向，但其治療效果差強(qiáng)人意。因此，探索乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，尋找特異性的治療靶點(diǎn)是十分必要的。

腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，可呈現(xiàn)出低脂狀態(tài)，即使在氧氣充足的條件下也會(huì)偏向使用糖酵解作用來取代正常細(xì)胞的有氧循環(huán)，這也是癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞的原因，即有氧糖酵解或Warburg效應(yīng)[4-5]。M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）是一種新的腫瘤生物標(biāo)志物，可產(chǎn)生癌癥特異性的Warburg效應(yīng)，調(diào)節(jié)葡萄糖的快速攝入，參與了乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。已有研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在乳腺癌組織中明顯升高，其表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)[6]。

近幾年，有關(guān)PKM2對(duì)腫瘤代謝作用的研究報(bào)道較多，但其在乳腺癌中作用的報(bào)道卻不甚詳盡，因此探討PKM2在乳腺癌組織中的表達(dá)，對(duì)了解乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，尋找乳腺癌治療的新靶點(diǎn)，具有重要的意義。本研究通過PCR技術(shù)檢測(cè)PKM2在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)水平，并探討其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，為乳腺癌尋找新的治療靶點(diǎn)，或?yàn)楦纳破漕A(yù)后找出新的方向，以期為乳腺癌的治療提供新的思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2018年10月至2020年10月在山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院（我院）收治的經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為原發(fā)性乳腺癌的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均接受手術(shù)治療；②患者入組前未行化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等；③患者有可測(cè)量病灶，癌組織直徑≥2 cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病例資料不完整的患者；②患有乳腺良性腫瘤及精神疾病者；③妊娠期和哺乳期患者；④因各種主觀和客觀原因無法配合或退出研究的患者。符合標(biāo)準(zhǔn)的乳腺癌患者共63例，年齡33～84歲，中位年齡為51歲。根據(jù)2022年《中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)乳腺癌診療指南》中關(guān)于絕經(jīng)的標(biāo)準(zhǔn)[7]：絕經(jīng)前狀態(tài)患者49例，絕經(jīng)狀態(tài)患者14例。左乳腺癌34例，右乳腺癌28例，雙乳癌1例。所有研究對(duì)象在手術(shù)完成后，在完整大標(biāo)本上從腫瘤中心向外切取部分癌組織（約1.0 cm×1.0 cm），在距癌組織邊緣至少＞5 cm處切取癌旁組織（約1.0 cm×1.0 cm），放入液氮，用于PCR檢測(cè)；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移主要依據(jù)影像學(xué)檢查CT、MRI結(jié)合核醫(yī)學(xué)骨掃描等情況以及患者隨訪期間轉(zhuǎn)移病灶情況綜合判定。本研究獲我院醫(yī)學(xué)和科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床病理參數(shù)

63例乳腺癌患者根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第七版的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[8]：腫瘤大小為T1（直徑≤2 cm）患者19例，腫瘤大小為T2（2 cm＜直徑≤5 cm）患者38例，腫瘤大小為T3（直徑＞5 cm）患者6例。Ⅰ期患者13例，Ⅱ期32例，Ⅲ期及以上18例。腫瘤增殖指數(shù)（Ki-67）：低Ki-67（≤30%）34例；高Ki-67（＞30%）29例。以影像學(xué)資料及術(shù)后病理為標(biāo)準(zhǔn)，有臨床淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者35例，無臨床淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者28例。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取及Real-time PCR 使用Thermo Fisher Scientific公司Trizol試劑盒從細(xì)胞中提取總RNA，然后使用天根生物科技有限公司產(chǎn)品Quant script RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，進(jìn)行RT檢測(cè)。通過以下引物檢測(cè)PKM2 RNA水平上的表達(dá)情況，F(xiàn)：5’-AAGGGTGTGAACCTTCCTGG-3’；R：5’-GCTCGACCCCAAACTTCAGA-3’。數(shù)據(jù)以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)表達(dá)水平顯示。GAPDH，F(xiàn)：5’-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3’；R：5’-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3’。PCR反應(yīng)體系中含2×SuperReal Pre Mix Plus 5 μl，正向引物（10 μm）0.3 μl，反向引物（10 μm）0.3 μl，cDNA模板1 μl，RNase-free dd H2O 3.4 μl，總體積10 μl。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 15 min，變性95℃ 20 s，退火56℃ 30 s，延伸68℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。提取實(shí)驗(yàn)CT值，進(jìn)行結(jié)果處理。

1.3.2 結(jié)果判斷 提取實(shí)驗(yàn)CT值，進(jìn)行結(jié)果處理。ΔΔCT法：A=CT（目的基因，待測(cè)樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本），B=CT（目的基因，對(duì)照樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本），K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism V 9.4軟件和SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布或方差齊性采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PKM2 mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；低Ki-67組、高Ki-67組、淋巴結(jié)陰性組、淋巴結(jié)陽性組PKM2 mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)量均高于乳腺癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；在乳腺癌組織中，高Ki-67組表達(dá)高于低Ki-67組，淋巴結(jié)陽性組表達(dá)高于淋巴結(jié)陰性組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表1、圖1～3。

表1 PKM2在乳腺癌組織及乳腺癌旁組織中的表達(dá)量比較（x ± s）

圖1 PKM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在乳腺癌組織與乳腺癌旁組織中比較（＊＊＊P ＜ 0.001）

圖2 亞組分析中Ki-67組PKM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在乳腺癌組織與乳腺癌旁組織中比較（＊＊＊P ＜ 0.001）

圖3 亞組分析中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PKM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在乳腺癌組織與乳腺癌旁組織中比較（＊＊＊P ＜ 0.001)

3 討論

乳腺癌具有高度的異質(zhì)性，無論在免疫表型、組織形態(tài)還是生物學(xué)行為方面都具有很大的差異，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制很復(fù)雜，與很多特異性腫瘤相關(guān)因子及復(fù)雜的信號(hào)通路有關(guān)，這決定了其預(yù)后也受多方面因素的影響，因此，目前迫切需要找到新的預(yù)后指標(biāo)或治療靶點(diǎn)，來指導(dǎo)乳腺癌的治療。

PKM2可產(chǎn)生癌癥特異性的Warburg效應(yīng)，參與乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。它由四個(gè)相同的亞基形成四聚體蛋白，每個(gè)亞基（或單體）包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括A、B、C和N端結(jié)構(gòu)域。單體首先二聚在一起，然后兩個(gè)二聚體再形成四聚體，這四種同工酶通常都以高活性的四聚體形式存在[9]。而腫瘤生長(zhǎng)因子可激活PKM2磷酸化位點(diǎn)，使其處于低活性的二聚體狀態(tài)，從而使乳腺癌細(xì)胞維持糖酵解表型，進(jìn)入旁路代謝途徑進(jìn)行生物合成；二聚體狀態(tài)的PKM2也可由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)，參與癌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及信號(hào)傳導(dǎo)等過程，并作為蛋白激酶磷酸化特殊的核蛋白，從而調(diào)控基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。

腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，與其預(yù)后不良相關(guān)，并可通過促進(jìn)癌細(xì)胞活力和侵襲能力來調(diào)控腫瘤進(jìn)展，從而促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[11]。PKM2在體內(nèi)和體外均可以負(fù)向調(diào)節(jié)組蛋白H2B單素化（H2Bub1）的水平，通過部分控制H2Bub1實(shí)現(xiàn)了致瘤功能。PKM2-H2Bub1軸可能成為一個(gè)有前景的癌癥治療靶點(diǎn)[12]。5-羥色胺可通過分別觸發(fā)Jak1/STAT3/ERK1/2和腺苷酸環(huán)化酶/PKA兩種不同的信號(hào)通路上調(diào)PKM2，從而促進(jìn)糖酵解及乳腺癌細(xì)胞的增殖和代謝[13]。有研究顯示[14]，PKM2高表達(dá)的新輔助化療患者的總生存期明顯短于PKM2低表達(dá)的患者。通過調(diào)控PKM2泛素化和降低PKM2穩(wěn)定性可以介導(dǎo)乳腺癌中紫杉類藥物耐藥的新信號(hào)通路[15]。此外，PKM2抑制劑聯(lián)合他莫昔芬有可能逆轉(zhuǎn)乳腺癌患者他莫昔芬耐藥[16]。因此，可以通過檢測(cè)腫瘤的PKM2蛋白表達(dá)來預(yù)測(cè)乳腺癌的預(yù)后和對(duì)化療及內(nèi)分泌治療的敏感性[14]。但也有研究顯示，雖然PKM2的敲除會(huì)降低癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但PKM2的敲除會(huì)加速同種異體移植腫瘤的生長(zhǎng)，從而揭示了PKM2在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和癌變中的細(xì)胞自主和系統(tǒng)性作用[17]。總之，PKM2在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，有可能成為一個(gè)潛在的乳腺癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，檢測(cè)的乳腺癌組織中，PKM2為（1.64±0.06），在乳腺癌中的表達(dá)量高于癌旁組織，證明了PKM2作為促癌基因，可在癌組織中高表達(dá)，這對(duì)預(yù)測(cè)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及篩查具有一定的意義。PKM2基因在高Ki-67和淋巴結(jié)陽性的乳腺癌組織中表達(dá)較高，提示PKM2與乳腺癌病情進(jìn)展也許存在關(guān)系，但仍需大數(shù)量樣本做進(jìn)一步研究。

綜上所述，PKM2無論腫瘤組織增殖水平高低、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移，在乳腺癌組織與乳腺癌旁組織間的表達(dá)水平均存在差異。本研究存在一定的不足，樣本量較少，且來源單一，未能涉及所有類型乳腺癌，且不同臨床病理參數(shù)做比較時(shí)，樣本量存在偏倚，存在不可比較的可能性，因此，PKM2可能作為預(yù)測(cè)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的潛在性標(biāo)志，但仍需進(jìn)一步研究。隨著對(duì)PKM2研究的深入，對(duì)其在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)的研究將為乳腺癌的治療提供更廣闊的道路，PKM2很可能成為新的潛在靶點(diǎn)，靶向PKM2的藥物也將在乳腺癌的治療中發(fā)揮更大的作用。