林妙東 周 潔 馬占忠 何劍芬 莊曉丹 朱慧樂 劉 貞 胡紅波粵北人民醫(yī)院，廣東韶關 512026

宮頸癌（cervical cancer，CC）是女性第四大常見癌癥，全世界每年新發(fā)病例超過500 000例，新增死亡病例約311 000例[1]。持續(xù)性的人乳頭瘤病毒（human papillonavirvs，HPV）感染在CC和宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的發(fā)病機制中起重要作用[2-3]。盡管持續(xù)性的宮頸HPV感染是宮頸癌前病變和CC發(fā)生的一個重要原因，但HPV的清除、持續(xù)感染與宮頸發(fā)生癌前病變并進展到癌變這一過程的驅動和協(xié)同致病因素還知之甚少。因此，研究協(xié)同或抑制從HPV感染向宮頸癌前病變和宮頸癌變發(fā)展的其他相關因素是至關重要的。越來越多的證據(jù)表明，陰道微生物群是這種轉變的關鍵因素。本研究基于Illumina高通量測序平臺和BIPES序列研究方法，檢測分析持續(xù)性HR-HPV感染者陰道菌群的特征，為揭示HR-HPV持續(xù)感染及其引起宮頸病變的機制提供線索和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年6月至2021年7月在粵北人民醫(yī)院（我院）婦科門診就診的女性，1年內曾接受兩次HPV檢查，且間隔時間超過6個月。將兩次檢測到相同亞型的HR-HPV納入持續(xù)HPV陽性組，共36例。兩次檢測HR-HPV均陰性者納入持續(xù)HPV陰性，共10例。納入標準：21～75歲女性；取樣前3 d內無性接觸和陰道給藥；1個月內未系統(tǒng)性使用抗生素或抗真菌藥。排除標準：妊娠期和產褥期女性；免疫缺陷疾病的女性。本研究已通過粵北人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（KY-2020-011）。全部入組患者已經(jīng)簽署知情同意書。

1.2 分組

1.2.1 按HR-HPV型別分組 HR-HPV陰性組有10例，年齡43～46歲，中位年齡43歲；單一HRHPV陽性組有22例，年齡44～52歲，中位年齡48歲；多重HR-HPV陽性組有14例，年齡38～51歲，中位年齡46歲。三組間年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。

1.2.2 按宮頸病變程度分組 HR-HPV陽性組中共有23例接受宮頸活檢，其中慢性炎癥組7例，年齡30～45歲，中位年齡39歲；低級別鱗狀上皮內病變（LSIL）組6例，年齡35～49歲，中位年齡42歲；高級別鱗狀上皮內病變（HSIL）組10例，年齡31～59歲，中位年齡43歲。三組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。

1.3 方法

1.3.1 陰道菌群檢測 ①樣本采集：受試者需要在月經(jīng)干凈后采樣，并在取樣前3 d禁止性生活及陰道局部用藥，用兩個無菌陰道棉簽收集陰道穹窿或陰道中側的分泌物，之后立即置于-80℃冰箱保存；②16SrRNA高通量測序：陰道菌群基因組提取、16SrRNA-V4區(qū)域基因片段的擴增、16SrRNA-V4區(qū)域基因高通量測序、生物信息學分析均外送至華大基因（武漢）完成。

1.3.2 HPV基因分型檢測 采用PCR-反向點雜交技術對宮頸脫落細胞標本進行14種高危型HPV基因分型檢測。

1.3.3 病理 對病變可疑的部位行宮頸活檢術和/或宮頸管搔刮術。組織標本由兩名以上的資深病理學專家分別進行病理診斷，診斷依據(jù)為2020年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（National comprehensive cancer network，NCCN）宮頸癌臨床實踐指南[4-5]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料不符合正態(tài)分布以中位數(shù)[M（P25，P75）]表示，采用非參數(shù)檢驗的秩和檢驗，兩組間比較采用曼-惠特尼（Man-whttey）檢驗（Z值），多組間采用Kruskal Wallis（H值）秩和檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同HR-HPV感染型別亞組間陰道菌群分析

圖1A，β多樣性分析顯示HR-HPV陰性組、單一HR-HPV陽性組、多重HR-HPV陽性組的陰道菌群結構比較，差異有統(tǒng)計學意義（H=12.872，P＜ 0.001）；圖1B顯示在HR-HPV陽性亞組中，單一HR-HPV陽性組和多重HR-HPV陽性組的陰道菌群結構比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.214，P＜ 0.001）。圖1C關鍵物種分析，在屬水平上，Lactobacillus菌屬、Prevotella菌屬、Anaerococcus菌屬和Dialister菌屬的占比存在差異，Lactobacillus菌屬在多重HR-HPV陽性組出現(xiàn)了明顯的豐度下調，差異有統(tǒng)計學意義（Z=4.647，P＜ 0.05）。Dialister菌屬在在多重HR-HPV陽性組出現(xiàn)了豐度上調，差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.479，P＜ 0.05）。圖1D顯示單一HR-HPV陽性組和多重HR-HPV陽性組之間存在豐度差異的關鍵陰道菌屬是Lactobacillus菌屬、Prevotella菌屬和Anaerococcus菌屬。

圖1 不同HR-HPV感染型別亞組間陰道菌群分析結果

2.2 不同級別宮頸病變組間陰道菌群分析

2.2.1 不同級別宮頸病變組間陰道菌群的β多樣性分析、PLS-DA分析 圖2A中所示，慢性炎癥組、LSIL組和HSIL組的陰道菌群結構比較，差異有統(tǒng)計學意義（H=11.653，P＜ 0.05）。圖2B和2C顯示，組間兩兩分析比對，慢性炎癥組與LSIL組、LSIL組與HSIL組的陰道菌群結構比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=2.782，2.649，P＜ 0.05）。圖2D是PLS-DA分析圖，顯示不同級別病變組陰道菌群的物種組成存在不同。

圖2 不同級別宮頸病變組間陰道菌群的β多樣性分析、PLS-DA分析

2.2.2 不同級別宮頸病變組間陰道菌群的微生物物種組成分析 分析不同級別宮頸組織病變組中陰道菌群占比前10的關鍵細菌屬，圖3A顯示慢性炎癥組和LSIL組間，Ureaplasma菌屬占比，差異有統(tǒng)計學意義（Z=2.816，P＜ 0.05）。圖3B顯示慢性炎癥組和HSIL組間，Enterococcus菌屬占比差異有統(tǒng)計學意義（Z=3.673，P＜ 0.05）。

圖3 不同級別宮頸病變組間陰道菌群的微生物物種組成分析

3 討論

3.1 持續(xù)HR-HPV感染的陰道菌群特征

本研究發(fā)現(xiàn)，單一型別和多重HR-HPV陽性組之間，存在乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）和Anaerococcus菌屬的占比差異，說明這些菌屬的豐度變化可能對HR-HPV的持續(xù)性感染或者清除產生了影響。HR-HPV陽性組中，普遍出現(xiàn)了Lactobacillus屬豐度下調。正常情況下，處于優(yōu)勢地位的乳酸桿菌屬能產生多種抑制物質，如乳酸和細菌素等以防止致病性感染，維持生殖器上皮表面的完整性，這一特征對于維持宮頸上皮屏障功能防止HPV進入基底層細胞很重要[6]，它們還能調節(jié)宿主的免疫功能，影響疾病的易感性[7]。因此，乳酸桿菌屬的減少引起的病原菌增殖、陰道微生物平衡破壞，增加了HR-HPV的易感性和持續(xù)感染狀態(tài)，最后導致宮頸病變的發(fā)生。

普雷沃氏菌屬（Prevotella）豐度在HR-HPV陽性的各亞組中均出現(xiàn)了不同程度的上調。普雷沃氏菌屬被證實與細菌性陰道病顯著相關，而細菌性陰道病已被證實與HR-HPV感染顯著相關，有研究證實普雷沃氏菌屬在CIN的發(fā)生發(fā)展中可作為生物標志物[8]。此外，普雷沃氏菌屬會產生膠原酶和纖溶酶，它們可以降解黏膜表面，促進陰道上皮細胞的脫落，以及唾液酸酶和脯氨酸酶，導致陰道上皮損傷，從而引起HR-HPV整合至鱗狀上皮細胞中，進而引起進一步病變[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，小桿菌屬（Dialister）的豐度在多重HR-HPV陽性組中出現(xiàn)上調。與既往研究結果相符合，小桿菌屬同樣是HR-HPV感染人群中出現(xiàn)的關鍵陰道菌群。陰道菌群存在小桿菌屬的女性，清除HPV更加困難，也更容易產生HPV的持續(xù)性感染[10]。但尚無研究探明小桿菌屬如何在抑制HPV清除的過程中發(fā)揮作用，這個菌屬同樣需要更進一步的研究。

3.2 不同級別的宮頸病變組的陰道菌群特征

本研究結果顯示HSIL組的陰道菌群物種多樣性表現(xiàn)出更加明顯的增加。既往有研究表明陰道菌群發(fā)生變化可能是HSIL發(fā)生發(fā)展的危險因素[11]。另一項支持這一結論的是HSIL女性手術切除前后的陰道菌群研究，該研究發(fā)現(xiàn)，HSIL患者乳桿菌屬的多樣性降低，同時伴有促炎細胞因子和抗菌肽濃度升高。錐切手術可以降低抗菌肽水平，但無法改變陰道微生物的組成或細胞因子水平。這意味著HSIL更傾向于發(fā)生在菌群多樣性減少的陰道環(huán)境中，而這種環(huán)境并不能通過手術切除病灶和清除HPV來糾正[12]。未能重建富含乳酸桿菌的陰道環(huán)境可能是HSIL患者術后出現(xiàn)HPV持續(xù)感染和HSIL復發(fā)的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)解脲支原體（Ureaplasma）在LSIL組中出現(xiàn)上調，提示LSIL的發(fā)生可能與解脲支原體相關，有研究表明，解脲支原體增加了HPV感染風險[13]，可能作為輔助因素影響HPV促進癌前病變導致CC[14]，同樣的，一項針對182名宮頸鱗狀上皮內病變女性的研究證實，宮頸鱗狀上皮內病變患者有顯著更高的解脲支原體感染率[15]。解脲支原體和宮頸病變致病機制的研究中發(fā)現(xiàn)，該菌屬可能參與了幾種復雜的感染相關的炎癥反應，包括產生一系列的反應性氧化代謝產物，促進趨化因子、細胞因子表達增加，抑制細胞介導的免疫反應，促使自由基的產生等[16]。有研究證實從LSIL組到宮頸癌組，腸球菌屬的豐度持續(xù)增加，宮頸癌組的豐度最高[17]。本研究HSIL組的腸球菌屬（Enterococcus）較慢性炎癥組出現(xiàn)了下調，與其結論不相符，需擴大樣本進一步證實腸球菌屬在宮頸疾病進程中的作用。

綜上所述，HR-HPV的持續(xù)性感染與陰道菌群的失衡密切相關。而本研究中發(fā)現(xiàn)HR-HPV感染相關的菌群包括乳酸桿、普雷沃氏等，尚無法完全明確這些菌屬在HPV持續(xù)感染抑或清除過程中發(fā)揮的具體作用，這也為下一步研究陰道菌群的變化與HPV持續(xù)感染并導致宮頸病變的機制提供了新方向。