陸昌彬

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院心內(nèi)科，福建廈門 361015

參松養(yǎng)心膠囊由人參、麥冬、山茱萸、丹參、酸棗仁（炒）、桑寄生、赤芍、甘松、黃連、南五味子、龍骨、土鱉蟲組成，具有益氣養(yǎng)陰，活血通絡(luò)，清心安神的功效，可用于治療室性早搏，氣陰兩虛，心絡(luò)瘀阻等臨床證型[1]。1990—2013年，在人口老齡化的趨勢(shì)下，中國患心血管疾病的病死人口數(shù)增加了46%[2-4]。研究表明，參松養(yǎng)心膠囊對(duì)于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q“冠心病”）的治療具有較好的效果[5]，但具體的藥理分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，挖掘參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的作用靶點(diǎn)，探究其治療冠心病的可能作用機(jī)制，為今后冠心病的相關(guān)研究提供思路和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 參松養(yǎng)心膠囊化學(xué)成分及靶點(diǎn)獲取

通過檢索中藥數(shù)據(jù)庫TCMSP（http: //lsp.wsuaf.edu.cn/tcmsp）以 及BATMAN-TCM（http: //bionet.ncpsb.org/batman-tcm），設(shè)定口服吸收率（oral absorption，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件，對(duì)所有的成分進(jìn)行檢索。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將檢索得到的成分轉(zhuǎn)為相應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2 冠心病靶點(diǎn)獲取

利 用Drugbank數(shù) 據(jù) 庫（https: //go.drugbank.com/）進(jìn)行關(guān)鍵詞“coronary heart disease”檢索，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)獲取

應(yīng)用Venny 2.1.0 （bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對(duì)藥物和疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行交集，篩選出二者的共同靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.7.1軟件建立藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)圖，每個(gè)節(jié)點(diǎn)（node）代表基因、蛋白或活性成分，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接（edge）代表活性成分與其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。

1.5 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將藥物與疾病共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。限定物種為人類（homo sapiens），設(shè)定最低相互作用閾值為中等置信（medium confidence）0.4，其余參數(shù)保持不變，得到蛋白相互作用關(guān)系，保持為TSV格式。將該TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，進(jìn)行靶點(diǎn)間網(wǎng)絡(luò)分析，并進(jìn)行可視化處理。

1.6 GO功能分析及KEGG信號(hào)通路富集分析

將參松養(yǎng)心治療冠心病的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因富集分析。設(shè)定Count值＞6，同時(shí)以P值＜0.01作為篩選條件，對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析以及KEGG分析。

2 結(jié)果

2.1 參松養(yǎng)心膠囊及冠心病主要靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過檢索參松養(yǎng)心化學(xué)成分，去除重復(fù)值后，共有185個(gè)化學(xué)成分。將所有篩選的化學(xué)成分導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫，去除重復(fù)值后，最終得到531個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。通過Drugbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行冠心病疾病靶點(diǎn)檢索，共檢索到216個(gè)。利用Venny 2.1.0繪制韋恩圖，同時(shí)得到共有靶點(diǎn)44個(gè)（圖1）。

圖1 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的藥物-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)分析

應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫及Cytoscape 3.7.1繪制靶蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。篩選出介數(shù)和度值大于中位數(shù)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，共得到6個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為SCN5A、IGHG1、NOS3、PDE3A、HTR2A、KCNH2。土鱉蟲、五味子兩味中藥與冠心病無交集靶點(diǎn)，在藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中剔除，其中丹參是對(duì)應(yīng)活性成分最多的中藥（圖3）。

圖2 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 參松養(yǎng)心膠囊與冠心病藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 核心靶點(diǎn)生物功能富集分析

應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析，共篩選出22個(gè)條目，其中生物過程（biological process，BP）條目6個(gè)，細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目11個(gè)，分子功能（molecular function，MF）相關(guān)條目5個(gè)（圖4）。

圖4 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的潛在作用靶點(diǎn)的GO分析

GO富集分析表明，生物過程主要包括鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控等過程。細(xì)胞成分主要包括細(xì)胞膜、神經(jīng)樹突、電壓門控鉀通道復(fù)合體。分子功能主要包括延遲整流鉀通道活性、電壓門控鉀通道活性等。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示，主要富集到靶點(diǎn)數(shù)量居前3位的信號(hào)通路包括5-羥色胺能突觸、鈣離子信號(hào)通路、縫隙連接（圖5）。

圖5 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的潛在作用靶點(diǎn)的KEGG信號(hào)通路富集

2.4 藥物作用機(jī)制分析

藥物活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)相互作用分析表明，參松養(yǎng)心膠囊中包含的12種活性成分作用主要作用于5-羥色胺能突觸、鈣離子信號(hào)通路。從KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果可得知5-羥色胺能突觸涉及9個(gè)作用基因，鈣離子信號(hào)通路涉及8個(gè)作用基因。根據(jù)藥物活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖的Degree值，其中靶標(biāo)HTR2A、NOS3與此作用過程關(guān)系最為密切，可能是參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖6）。

圖6 參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的“藥物活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的作用機(jī)制進(jìn)行探究。結(jié)果表明，參松養(yǎng)心膠囊共含有12味中藥，有效活性成分共185個(gè)，對(duì)應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)共531個(gè)，其中冠心病相關(guān)靶點(diǎn)216個(gè)。冠心病與參松養(yǎng)心膠囊共有基因44個(gè)，通過藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)丹參在參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的作用尤為突出。

心血管疾病包括冠心病、風(fēng)濕性心臟病、周圍血管疾病、心力衰竭、先天性心臟病和心肌病等[6]。丹參被廣泛用于心血管疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化、心絞痛等[7]，研究表明，丹參可以明顯改善胸痛、胸悶、心悸、呼吸急促等臨床癥狀，使冠心病患者心電圖逐漸趨于正常[7]。丹參的主要化學(xué)成分超過200種，可分為水溶性（親水性）酚類化合物和非極性（脂溶性）二萜類化合物兩大類。丹酚酸和二萜丹參酮是本植物中兩種具有代表性的親水性和親脂性成分[8]。丹參的心血管保護(hù)作用有多種機(jī)制，包括抗炎、抗氧化、抗血栓、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞中黏附分子的表達(dá)，急性心肌缺血的改善等[9]。

本研究結(jié)果顯示，HTR2A、NOS3是參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病過程中最核心的靶點(diǎn)。一氧化氮（NO）是最具有特征性的內(nèi)皮源性舒張因子，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的能力降低時(shí)，可能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等一系列事件[10]，因此，NO在內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)冠心病的保護(hù)中起關(guān)鍵作用[11]。內(nèi)皮細(xì)胞通過提高NOS3的活性來對(duì)抗凝血酶和血小板產(chǎn)物的作用在體內(nèi)外都得到了證實(shí)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死的發(fā)展過程中，NOS3生成減少及活性降低可導(dǎo)致cAMP產(chǎn)生增加，激活蛋白激酶A（PKA）導(dǎo)致L型鈣通道的磷酸化和隨后的鈣內(nèi)流，進(jìn)而導(dǎo)致血管平滑肌收縮[12]。應(yīng)用丹參的主要成分丹酚酸B處理可降低H9C2細(xì)胞（胚胎大鼠心室肌源性細(xì)胞系）Ca2+和cAMP，抑制PKA[13]，從而發(fā)揮舒張血管平滑肌的功能。

5-HT受體分為14種亞型[14]，其中5-HT2A受體在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)多種不同的5-HT生理功能，將其阻斷是治療精神分裂癥、失眠和缺血性心臟病等多種疾病的有效方法[15]。血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。5-HT可激活血管平滑肌細(xì)胞5-HT2A受體，通過內(nèi)皮細(xì)胞中5-HT1B受體的NO依賴機(jī)制而引起血管收縮[16]。5-HT2A受體還可以增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，釋放細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+和/或激活L型Ca2+通道[17]。因此，參松養(yǎng)心膠囊對(duì)于冠心病的治療可能是通過激活NOS3并阻斷5-HT2A受體而實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，KEGG信號(hào)通路富集分析也發(fā)現(xiàn)參松養(yǎng)心膠囊對(duì)于冠心病的治療在5-HT神經(jīng)突觸、鈣離子信號(hào)通路最為突出。這一與本研究上述的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)參松養(yǎng)心膠囊治療冠心病的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，參松養(yǎng)心膠囊主要通過丹參，輔以其他中藥，激活NOS3并阻斷5-HT2A受體，同時(shí)通過5-羥色胺能突觸、鈣離子信號(hào)通路發(fā)揮治療冠心病的作用。本研究為參松養(yǎng)心膠囊的進(jìn)一步的基礎(chǔ)與臨床的研究提供了理論支持。