付冬梅， 周婧， 王浪， 楊昕， 蘭紅， 李素蘭， 王勁， 方婕

1.資陽市雁江區(qū)人民醫(yī)院口腔科，四川 資陽（641300）； 2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院正畸科，四川 成都（610041）

在現(xiàn)有的治療骨缺損技術(shù)中，引導(dǎo)骨再生技術(shù)已經(jīng)被廣泛運用［1］，但該技術(shù)使用的骨代替材料只有引導(dǎo)成骨的作用，且手術(shù)后恢復(fù)時間較長，使用的骨材料成本較高，嚴(yán)重影響了骨缺損修復(fù)的效果，增加患處炎癥免疫反應(yīng)和感染的風(fēng)險［2］，因此尋求一種安全可靠、成本低、生物活性好的骨再生材料一直是骨缺損技術(shù)研究的重點。

改良型富血小板纖維蛋白（advanced plateletrich fibrin，A-PRF）被證實可促進軟硬組織的愈合及再生，并能有效應(yīng)用于口腔頜面外科、整形外科、運動醫(yī)學(xué)、牙周病學(xué)等多方面［3-4］。臨床研究證實A-PRF 可作為生物活性材料單獨或結(jié)合其他骨移植材料促進骨再生。β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）具有良好的生物相容性、骨引導(dǎo)性及生物降解性能，臨床上主要應(yīng)用作為支架材料引導(dǎo)骨再生，如牙槽嵴裂骨缺損修復(fù)、位點保存、種植術(shù)區(qū)缺損修復(fù)，或者聯(lián)合其他材料誘導(dǎo)骨再生，均取得良好的骨再生效果。本實驗擬通過新西蘭兔股骨缺損模型進一步探討A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物誘導(dǎo)成骨的作用與可能涉及的機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

取清潔級新西蘭大白兔24 只，雄性，5 ～6 月齡，體質(zhì)量3 ～3.5 kg，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030。本實驗經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院動物倫理委員會審批通過（20220916006）。

1.2 試劑與儀器

A-PRF 在華西醫(yī)院動物實驗室提取，β-TCP（奧林巴斯泰爾茂生物材料株式會社，日本）；二甲苯（天津致遠化學(xué)試劑有限公司，中國）；DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司，中國）；RNA 提取試劑盒（合肥博美生物科技有限公司，中國）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，中國）；RT-PCR 試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，中國）；熒光TUNEL 檢測試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，中國）；骨保護素（osteoprotegerin，OPG）（艾博抗貿(mào)易有限公司，中國）；人核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）（艾博抗貿(mào)易有限公司，中國）；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）（艾博抗貿(mào)易有限公司，中國）；磷酸化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（phospho-cysteine aspartic protease-3，p-Caspase3）（艾博抗貿(mào)易有限公司，中國）；磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38（phospho-mitogen-activated protein kinase p38，p-p38MAPK）抗體（CST 公司，美國）；二抗工作液（北京中杉金橋生物有限公司，中國）。Micro-CT（SkyScan 1276，Bruker，德國）；實時熒光定量儀（PIKORed 96，Thermo，美國）；酶標(biāo)儀（Multiskan Sky，Thermo，美國）；熱 循 環(huán) 儀（TCA0096，Thermo，美 國）；顯 微 鏡（CX33，Olympus，日本），掃描電鏡（S-4800，日立，日本）。

1.3 實驗分組與方法

1.3.1 構(gòu)建兔股骨缺損模型與分組 24 只新西蘭大白兔分為4 組：模型組、1∶1 復(fù)合物組（A-PRF∶β-TCP=1∶1）、2∶1 復(fù)合物組（A-PRF∶β-TCP=2∶1）與4∶1 復(fù)合物組（A-PRF∶β-TCP=4∶1）。各組動物耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液（1 mL/kg）進行麻醉，自雙后肢膝關(guān)節(jié)外側(cè)距前緣1.0 ～1.5 cm 處，平行前緣作一長約5 cm 弧形切口；逐層分離暴露股骨外側(cè)髁，用骨鉆制備直徑為6 mm、深8 mm 的圓柱形骨全層缺損。于距離骨缺損中央6 mm 處，左右對稱各旋入1枚直徑為2 mm的鈦釘進行定位（圖1）。模型組不作處理，復(fù)合物組在骨缺損區(qū)域填充0.5 mL 復(fù)合物，所有動物均用醫(yī)用膠原修復(fù)膜覆蓋，術(shù)后3 d內(nèi)每天肌肉注射青霉素鈉80萬U。術(shù)后8 周安樂法處死動物，收集股骨組織進行后續(xù)指標(biāo)檢測。

Figure 1 Construction of rabbit femoral defect model圖1 構(gòu)建兔股骨缺損模型

1.3.2 Micro-CT 掃描分析股骨缺損情況 使用動物Micro-CT 掃描分析儀測定新生股骨組織中骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分離度（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N），掃描條件：掃描高度1.5 cm，層距19 μm，跨越780～800層，曝光時間1 800 ms，管電壓80 kV，管電流500 μA。

1.3.3 組織病理學(xué)檢測 將各組動物的新生股骨組織在4%多聚甲醛中固定24 h 以上，依次進行脫鈣、脫水處理，制作石蠟切片，最后使用蘇木精-伊紅染色法（HE 染色）進行染色，觀察新生骨組織中血管形成情況與病變情況。

1.3.4 掃描電鏡觀察組織形態(tài) 將各組動物新生股骨組織制備成掃描電鏡樣本，使用掃描電鏡觀察組織中骨形態(tài)結(jié)構(gòu)、膠原纖維、成骨細胞附著等情況。

1.3.5 酶聯(lián)免疫法檢測新生股骨組織中p-p38MAPK、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）、p-Caspase3 的含量 將收集的各組動物新生股骨組織置于液氮中研磨，制成組織勻漿，4 000 r/min 離心10 min 收集上清液，按ELISA 檢測試劑盒說明書操作測 定 組 織 中p-p38MAPK、CHOP、p-caspase3 的含量。

1.3.6 免疫組織化學(xué)觀察成骨相關(guān)蛋白表達 將1.3.3 中制成的石蠟切片脫蠟至水，然后將切片置于二甲苯中3 次，每次15 min，置于無水乙醇中2 次，每次5 min，再分別置于85%（v/v）、75%（v/v）乙醇溶液中5 min，最后用蒸餾水清洗。將處理好的切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0），微波爐高火加熱10 min，?；? min，中高火再加熱10 min；冷卻后，使用PBS 清洗3 次，每次5 min，在3%雙氧水中室溫靜置10 min，取出使用PBS 清洗3 次，每次5 min；滴加山羊血清封閉液，室溫封閉20 min，然后滴加一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜；PBS 洗3 次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃室溫孵育30 min，使用PBS 清洗3 次，每次5 min；孵育完成后將新鮮配置的DAB 顯色液滴加到組織上，室溫顯色，在顯微鏡觀察下控制顯色時間，當(dāng)顏色為棕黃色時，蒸餾水洗滌終止顯色；加入蘇木素復(fù)染3 min，清水返藍后流水沖洗；最后將切片依次置于75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯中浸泡10 min，中性樹膠封片。使用顯微攝像系統(tǒng)對切片進行圖像采集，每例樣本在400 倍下分別采集3 個視野進行拍照，計算每張圖像的平均光密度，使用3 張圖像的平均光密度再計算每例樣本的平均光密度，觀察新生骨組織中OPG、BMP-2、RANKL、p-p38MAPK與p-Caspase3 蛋白表達情況。

1.3.7 熒光TUNEL 染色觀察新生股骨組織細胞凋亡情況 收集各組動物新生骨痂組織，放入4%多聚甲醇中固定過夜，制備石蠟切片。用TUNEL 熒光試劑盒染色，觀察新生骨組織細胞凋亡情況。

1.3.8 RT-qPCR 將收集的各組動物新生股骨組織置于液氮中研磨，按RNA 提取試劑盒與RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行總RNA 提取與cDNA 逆轉(zhuǎn)錄，然后使用RT-PCR 儀擴增，最后計算各組樣本的CT 值，通過計算2-△△CT值反映OPG、BMP-2、RANKL、p38MAPK 基因的相對表達水平。引物序列：OPG：F：5’-GGACCATGCAGGAAACCCTT-3’，R：5’-CCTGTGCTTCACACAGAACTC-3’；BMP-2：F：5’-TTGGTCACGATGGGAAGGGG-3’，R：5’-TGTGCTAACGACACCCACAA-3’；RANKL：F：5’-TCGACTCTGGAGAGCGAAGA-3’，R：5’-GAGCCACGAACCTTCCATCA-3’；p38MAPK：F：5’-GAGAGGCAGACGCTAAGCAG-3’，R：5’-GGCGATTCTCTCACTGAGCC-3’；GAPDH：5’-ACGACCACTTCGGCATTGTG-3’，R：5’-CAGTGAGTTTCCCGTTCAGC-3’。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)提供。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，進一步組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同比例的A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔股骨缺損的修復(fù)效果

Micro-CT 檢測骨組織發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，各復(fù)合物組動物股骨組織中BMD 含量、BV/TV 比例、Tb.Th 與Tb.N 均升高，Tb.Sp 降低（P＜0.05），見表1。模型組動物骨小梁間髓腔較大，新生骨小梁較少，存在缺損未愈合區(qū)域；復(fù)合物組缺損區(qū)域基本填滿新生骨組織，其中1∶1 復(fù)合物組修復(fù)效果較差，2∶1 復(fù)合物組修復(fù)效果最好。

表1 不同比例的富血小板纖維蛋白/β-三磷酸鈣復(fù)合物組新生骨指標(biāo)比較Table 1 Comparison of new bone index between advanced platelet-rich fibrin and β-tricalcium phosphate complex composites with different proportions

掃描電鏡結(jié)果顯示，模型組動物缺損區(qū)域出現(xiàn)少量骨小梁，纖維組織增生不明顯，成骨細胞附著不明顯；復(fù)合物組缺損區(qū)域可見新生骨小梁大量形成，大量成骨細胞附著，纖維組織增生明顯，以2∶1 復(fù)合物組修復(fù)程度最為突出。HE 染色結(jié)果顯示，模型組骨組織之間可見骨損傷區(qū)域，炎性細胞浸潤情況明顯。與模型組相比，各復(fù)合物組骨損傷區(qū)域、炎性細胞浸潤情況較少，且見新生毛細血管形成，恢復(fù)程度2∶1 比例最佳，4∶1 比例次之，1∶1 較弱。見圖2。

Figure 2 Comparison of repair effects of advanced platelet-rich fibrin and β-tricalcium phosphate complex with different proportions on rabbit femoral defects圖2 不同比例的富血小板纖維蛋白/β-磷酸三鈣復(fù)合物組兔股骨缺損的修復(fù)效果比較

2.2 不同比例的A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔新生股骨組織中細胞凋亡的影響

與模型組相比，1∶1 復(fù)合物組、2∶1 復(fù)合物組與4∶1 復(fù)合物組樣本中細胞凋亡率均顯著性降低，2∶1 復(fù)合物組下降幅度最大（P＜0.05），見表2。

表2 不同比例的富血小板纖維蛋白/β-磷酸三鈣復(fù)合物組新生骨組織中凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rate in newborn bone tissue between advanced platelet-rich fibrin and β-tricalcium phosphate complex composites with different proportions

2.3 不同比例的A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔新生股骨組織中p-p38MAPK、CHOP、p-Caspase3 的影響

與模型組相比，2∶1 復(fù)合物組與4∶1 復(fù)合物組新生骨組織中p-p38MAPK、CHOP、p-Caspase3 含量顯著性降低（P＜0.05），而1∶1 復(fù)合物組新生股骨樣本中p-p38MAPK、p-Caspase3 含量均無顯著性變 化（P＞0.05），CHOP 含量降低（P＜0.05），pp38MAPK、CHOP、p-Caspase3 組間統(tǒng)計量值為（F=3.168，3.283，3.238；P=0.043，0.038，0.040），見圖3。

Figure 3 Comparison of the contents of p-p38MAPK,CHOP and p-Caspase3 in newborn bone tissues between advanced platelet-rich fibrin and β-tricalcium phosphate complex composites with different proportions圖3 不同比例的A-PRF/β-TCP 復(fù)合物組新生骨組織中p-p38MAPK、CHOP、p-Caspase3 的蛋白表達情況

2.4 不同比例的A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔新生股骨組織中OPG/RANKL/RANK 通路與P38MAPK通路的影響

與模型組相比，1∶1 復(fù)合物組新生股骨樣本中BMP-2 的mRNA 升高（P＜0.05），OPG、RANKL 與p38MAPK 的mRNA 則無顯著變化（P＞0.05），而2∶1復(fù)合物組與4∶1 復(fù)合物組樣本中OPG 和BMP-2 的mRNA 均升高，RANKL 和p38MAPK 的mRNA 表達量降低（P＜0.05），各組OPG、BMP-2、RANKL 和p38MAPK 組間統(tǒng)計量值為（F=15.65，6.522，7.048，12.29；P=0.001，0.002，0.002，0.001），見圖4a。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與模型組相比，2∶1復(fù)合物組與4∶1 復(fù)合物組新生骨組織中OPG 和BMP-2 蛋白表達水平升高，RANKL、p-p38MAPK 與p-Caspase3 蛋白表達水平下降（P＜0.05），而1∶1 復(fù)合物組新生股骨樣本中5 種蛋白的表達水平均無變化（P＞0.05）。各組OPG、BMP-2、RANKL、pp38MAPK 與p-Caspase3 組間統(tǒng)計量值為（F=4.498，8.916，43.19，12.56，7.026；P= 0.040，0.006，0.000，0.002，0.012），見圖4b、4c。

Figure 4 Expression of osteogenesis related genes in newborn femur between advanced platelet-rich fibrin and β-tricalcium phosphate complex composites with different proportions圖4 不同比例的A-PRF/β-TCP 復(fù)合物組新生股骨組織中成骨相關(guān)基因的表達情況

3 討 論

目前，臨床上使用的骨代替材料只有引導(dǎo)成骨作用，存在手術(shù)后并發(fā)癥多等問題，嚴(yán)重影響了骨缺損修復(fù)治療的開展［5］。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，A-PRF 被證實可促進軟硬組織的愈合及再生。目前有學(xué)者通過不同比例的A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物研究其誘導(dǎo)骨再生的效果，取得一定進展［3］，但涉及的機制仍不明確，不利于復(fù)合物的改良與發(fā)展。本實驗發(fā)現(xiàn)A-PRF 和β-TCP 的比例為2∶1 時，抑制p38MAPK 通路減少細胞凋亡的發(fā)生，介導(dǎo)OPG/RANKL/RANK 通路加快骨缺損修復(fù)。Micro-CT 技術(shù)可全方位獲得組織內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)圖像，可直接觀察新生骨與填充材料的結(jié)合情況［6］。本實驗通過Micro-CT 輔助結(jié)合組織病理學(xué)與掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)A-PRF 和β-TCP 的配比為2∶1 時，骨缺損區(qū)域中新生骨與填充材料的結(jié)合程度最好，誘導(dǎo)新生骨的形成情況最多，BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N 指標(biāo)均升高，纖維組織增生明顯，骨細胞聚集增多與骨結(jié)構(gòu)形成情況良好。這可能與APRF 具有高黏附性的膜性特點，利于細胞黏附，降解過程中所釋放的生長因子可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細胞等的骨向分化與成骨細胞的附著、增殖和分化有關(guān)，但不建議與β-TCP 的構(gòu)成比例超過2∶1，因為A-PRF 在會隨著時間被體內(nèi)蛋白酶降解、吸收，濃度過高會導(dǎo)致其釋放的生長因子速度降低，誘導(dǎo)骨形成速度減慢，減弱β-TCP 誘導(dǎo)新生骨建成的速度與骨結(jié)構(gòu)框架的形成效果。

在骨形成過程中，多種骨細胞、細胞因子和基因的相互作用促使骨組織恢復(fù)原有的結(jié)構(gòu)和功能［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，OPG/RANKL/RANK 通路在調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)和骨質(zhì)量方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。RANKL可與位于破骨細胞膜上的RANK 特異性結(jié)合，觸發(fā)一系列細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)［9］。OPG 是腫瘤壞死因子受體家族成員，具有抑制破骨細胞分化、增加骨密度的功能［10］。OPG 可直接與RANKL 結(jié)合，抑制RANKL 與RANK 的結(jié)合，從而抑制破骨細胞的激活。OPG/RANKL/RANK 共同構(gòu)成破骨細胞分化和骨吸收的關(guān)鍵信號通路［11］。BMP 家族蛋白被認為與組織異位骨化形成和干細胞成骨分化潛能密切相關(guān)［12］，其中BMP-2 已被證明能夠參與骨修復(fù)［13］。在本實驗中，使用復(fù)合物填充后，骨缺損區(qū)域骨形成顯著增多，新生骨組織中OPG 基因與蛋白的表達水平顯著性升高，RANKL 基因與蛋白表達顯著性下降，說明復(fù)合物通過增加OPG 的含量，減少RANKL 表達，抑制破骨細胞的分化，同時增加BMP-2 的表達，進一步誘導(dǎo)骨形成，填補缺損。

MAPK 信號通路是細胞表面到細胞核內(nèi)部的重要信號傳遞，p38 是其中一條途徑上的關(guān)鍵激酶［14］。MAPK 通路激活后誘導(dǎo)細胞質(zhì)中的p38 磷酸化進入細胞核促進CHOP、Caspase3 表達與活化，促進細胞凋亡［15］，與OPG/RANKL/RANK 通路在成骨途徑中也具有相互作用的關(guān)系［16］。當(dāng)RANKL/RANK 復(fù)合體形成后，能通過TRAF6 激活MAPK 家族蛋白表達［17］，誘發(fā)骨質(zhì)疏松、骨不愈合等疾病，這說明MAPK 信號通路有可能通過直接調(diào)控OPG/RANKL/RANK 通路上的關(guān)鍵基因?qū)Τ晒欠只c骨再生進行干預(yù)。本實驗中發(fā)現(xiàn)，填充復(fù)合物后，新生骨組織中p38MAPK 基因表達量下降，p-p38MAPK、CHOP 與p-Caspase3 的表達減少，說明復(fù)合物不僅能抑制MAPK 通路，減少下游CHOP 與p-Caspase3的含量，抑制細胞凋亡，還能減少p38MAPK 磷酸化，抑制RANKL/RANK 通路，減少破骨細胞分化，加速骨再生與保護新生骨組織。同時還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)A-PRF 和β-TCP 復(fù) 合 物 構(gòu) 成 比 例 為2∶1 時 對p38MAPK 通路抑制效果較強。

綜上所述，由A-PRF 與β-TCP 組成復(fù)合物能促進OPG 表 達，抑 制RANKL 表 達 和p38MAPK 磷 酸化，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，減少新生骨細胞凋亡，誘導(dǎo)成骨分化。目前A-PRF 與β-TCP 均是組織工程學(xué)上常用的材料，但將兩者結(jié)合用于組織修復(fù)的研究比較少，其復(fù)合物幫助組織重塑與再生的潛力十分巨大，如能在此基礎(chǔ)上針對不同組織或信號通路結(jié)合對應(yīng)靶點藥物，能在針對性修復(fù)組織的同時減少并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險，使其成為一種安全可靠、成本低、生物活性好的骨再生材料。

【Author contributions】 Fu DM designed the study, performed the experiments and wrote the article. Zhou J, Wang L, Yang X, Lan H, Li SL,Wang J and Fang J performed the experiments and revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.