趙 穎 章 勤 陳眾芳 王如燁 馬 景

Chambers 等[1]統(tǒng)計(jì)全球76 個(gè)國(guó)家體外受精和卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射胚胎移植后分娩率分別為19.9%和24.3%，控制性卵巢刺激（control ovarian stimulation，COS）是主要影響因素之一[2]。COS 采用超生理劑量的促性腺激素，誘發(fā)多個(gè)卵子同時(shí)發(fā)育與成熟，從而獲得更多的胚胎以用于移植[3]。超過4 次的COS 被稱為反復(fù)促排[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，接受3 次以上的重復(fù)COS 可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞數(shù)量顯著減少，優(yōu)胚數(shù)、植入率和臨床妊娠率顯著降低[6-7]。過度氧化應(yīng)激引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）在卵巢內(nèi)的積累被認(rèn)為可能是導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能低下、卵母細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。反復(fù)COS 不但能擾亂卵母細(xì)胞中紡錘體組織和染色體排列、改變?cè)缙谂咛ブ械慕M蛋白修飾，從而影響胚胎發(fā)育潛能[8-9]，而且能明顯升高卵巢ROS 水平，增加卵巢中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，可能通過p16 和SIRT1/FOXO1 信號(hào)通路顯著降低卵巢功能，但其對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞功能、卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響仍無定論[10]。線粒體是ROS 最易影響的靶點(diǎn)，線粒體功能障礙可能導(dǎo)致受精失敗、胚胎發(fā)育潛能下降，ROS 作為c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal protein kinase，JNK）的有效誘導(dǎo)劑，可能通過p53 作用介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，本實(shí)驗(yàn)從ROSJNK-p53-線粒體功能的角度探索反復(fù)超促排對(duì)老齡雌性小鼠卵巢功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只SPF 級(jí)7 月齡的雌性C57BL/6 小鼠（28～33 g），均從維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買（證書號(hào)：SCXK 2019-0001）。小鼠在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心的屏障設(shè)施中以恒溫、恒濕和自然光循環(huán)的條件飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查（批準(zhǔn)編號(hào)：20201123-01）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 粉末型孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonado-tropin，PMSG）試劑盒（江蘇易核生物有限公司，批號(hào)2001A）；粉末型人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）試劑盒（江蘇易核生物有限公司，批號(hào)2003A）；小鼠雌二醇（estradiol，E2）酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（凡科維生物有限公司，批號(hào)21010279M）；小鼠孕酮（progesterone，P）ELISA 試劑盒（凡科維生物有限公司，批號(hào)21010279M）；小鼠抑制素B（inhibin-B，INHB）ELISA 試劑盒（凡科維生物有限公司，批號(hào)21022171M）；ROS（DCFH-DA 探針）試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)112420201215）；RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，批號(hào)RR036Q），熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TAKARA，批號(hào)RR420L）。熒光倒置顯微鏡（蔡司，Axio Observer.A1）；光學(xué)顯微鏡（Motic，AE2000）；透射電子顯微鏡（HITACHI，H7650）；熒光定量PCR 儀（ABI，Step-OnePlus）。

1.3 建立反復(fù)超促排小鼠模型 依據(jù)文獻(xiàn)[5]將30只7 月齡的C57BL/6 雌鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法平均分成兩組，其中15 只腹腔注射15 IU PMSG，48 h 后注射15 IU hCG，每周1 次，連續(xù)4 周。剩余15 只小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前2 d 按促排流程腹腔注射PMSG 15 IU、hCG 15 IU 1 次。經(jīng)歷4 次COS 的老齡雌性小鼠為模型組，僅在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前接受1 次COS 的老齡雌性小鼠為對(duì)照組。

1.4 ELISA 法檢測(cè)血清中生殖激素水平 在最后1次COS 注射hCG 16 h 后，小鼠頜下靜脈取血，室溫靜置1 h 后以3000 r/min 離心15 min，取上清，根據(jù)說明書，使用ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清E2、P 和INHB 水平。

1.5 體式顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞形態(tài)、ROS 水平檢測(cè) 在最后1 次COS 注射hCG 16 h 后解剖小鼠，取輸卵管壺腹部置于含Hepes 緩沖液的試管中，壺腹部突起處用鋒利的針頭劃開，使卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合物（cumulus-oocyte complexs，COCs）滑出[11]。小鼠COCs 被放入含有透明質(zhì)酸酶的預(yù)制Hepes 緩沖液中，消化5～10 min 后于體式顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，收集并用于隨后的實(shí)驗(yàn)；卵母細(xì)胞ROS 水平檢測(cè)通過DCFH-DA 探針方法進(jìn)行。卵母細(xì)胞在PBS 中用10 mM DCFH-DA 孵育20 min，每隔3～5 min 顛倒混勻，而后在37 ℃條件下PBS 洗3次，在熒光倒置顯微鏡下觀察、拍照并用Image J 計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.6 HE 染色觀察卵巢中各級(jí)卵泡及黃體數(shù)量 小鼠卵巢組織于4%甲醛固定后，脫水，石蠟包埋、切片，獲得厚度為4 μm 的卵巢切片并進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢結(jié)構(gòu)并進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)并拍照。

1.7 透射電鏡觀察卵巢顆粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 解剖小鼠后，1 min 內(nèi)快速用眼科鑷子分離一側(cè)卵巢，并在冰上用手術(shù)刀片切下大小約1 mm×1 mm×1 mm 的卵巢組織，放入提前預(yù)冷的2.5%戊二醛中固定。經(jīng)過漂洗、1%鋨酸固定、脫水包埋、固化后，用超薄切片機(jī)獲得約60 nm 切片并用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察線粒體的形態(tài)，計(jì)算嵴模糊的線粒體及空泡征占比。

1.8 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)卵巢JNK、Bcl2 關(guān)聯(lián)X 蛋白（Bax）、人體抑癌基因（p53）、叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O 亞型（FOXO3a）mRNA 表達(dá)水平 取小鼠卵巢液氮冷凍，后移至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。取卵巢樣品加入?.5 mL 滅菌管中，加入裂解Buffer并進(jìn)行組織破碎、吹打至無明顯沉淀，RNA 提取試劑盒提取卵巢總RNA，RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒在普通PCR 儀中將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，用熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ配置反應(yīng)體系，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。條件：預(yù)變性95 ℃3 min；而后40 個(gè)循環(huán)（95 ℃10 s，60 ℃30 s）；所有數(shù)據(jù)采用ABI StepOnePlus PCR 儀收集，轉(zhuǎn)錄水平通過公式2-△△CT計(jì)算，以β-actin 作為內(nèi)參，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 RT-qPCR 引物設(shè)計(jì)

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 符合正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，應(yīng)用Prism Graphpad 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，方差齊的數(shù)據(jù)通過獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)分析組間差異，方差不齊者用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E2、P、INHB 水平 與對(duì)照組比較，模型組小鼠的E2、P 及INHB 水平均顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠血清E2、P、INHB 水平比較（）

表2 各組小鼠血清E2、P、INHB 水平比較（）

注：對(duì)照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復(fù)超促排；E2 為雌二醇；P 為孕酮；INHB 為抑制素B；與對(duì)照組比較，aP＜0.01

2.2 超促排后獲得卵子數(shù)量、破碎卵母細(xì)胞比率及ROS 值 與對(duì)照組比較，促排后模型組獲得的卵子數(shù)量明顯降低，其中破碎卵母細(xì)胞的比率明顯升高（P＜0.01）。模型組卵母細(xì)胞的ROS 值較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）。見表3 及圖1、2。

表3 各組小鼠卵子數(shù)量、碎裂比率及卵母細(xì)胞ROS 水平比較（）

表3 各組小鼠卵子數(shù)量、碎裂比率及卵母細(xì)胞ROS 水平比較（）

注：對(duì)照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復(fù)超促排；ROS 為活性氧；與對(duì)照組比較，aP＜0.01

圖1 體式顯微鏡下的卵母細(xì)胞形態(tài)

圖2 熒光倒置顯微鏡下卵母細(xì)胞ROS 熒光強(qiáng)度

2.3 卵巢各級(jí)卵泡及黃體數(shù)量及顆粒細(xì)胞線粒體形態(tài) 模型組小鼠卵巢中的原始卵泡較對(duì)照組明顯減少（P＜0.01），其發(fā)育卵泡（包括竇卵泡及成熟卵泡）均較對(duì)照組減少（P＜0.05），而閉鎖卵泡數(shù)量較對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表4 和圖3）。模型組小鼠的黃體數(shù)量較對(duì)照組明顯增多（P＜0.05），透射電鏡下可見對(duì)照組小鼠的顆粒細(xì)胞周圍多為正常線粒體，其結(jié)構(gòu)規(guī)則，呈圓形或桿狀，嵴清晰完整。而模型組有較多異常線粒體，呈現(xiàn)腫脹、聚集、融合的狀態(tài)，其嵴模糊或斷裂，部分空泡化。相較于對(duì)照組，模型組線粒體空泡征及線粒體嵴模糊發(fā)生率更高（P＜0.01），見表5 和圖4。

圖3 卵巢病理圖片（HE 染色）

圖4 透射電鏡下卵巢顆粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色）

表4 各組小鼠原始卵泡、發(fā)育卵泡、閉鎖卵泡及黃體數(shù)量比較（個(gè)，）

表4 各組小鼠原始卵泡、發(fā)育卵泡、閉鎖卵泡及黃體數(shù)量比較（個(gè)，）

注：對(duì)照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復(fù)超促排；與對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

表5 各組小鼠線粒體嵴模糊及空泡征發(fā)生率比較（%，）

表5 各組小鼠線粒體嵴模糊及空泡征發(fā)生率比較（%，）

注：對(duì)照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復(fù)超促排；與對(duì)照組比較，aP＜0.01

2.4 卵巢中的凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，模型組小鼠的JNK、p53、Bax mRNA 表達(dá)均升高（P＜0.05），而FOXO3a mRNA 表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。見表6。

表6 各組小鼠卵巢JNK、p53、Bax、FOXO3a 基因表達(dá)水平比較（）

表6 各組小鼠卵巢JNK、p53、Bax、FOXO3a 基因表達(dá)水平比較（）

注：對(duì)照組接受1 次超促排；模型組接受4 次反復(fù)超促排；JNK 為c-Jun 氨基末端激酶；p53 為人體抑癌基因；Bax 為Bcl2 關(guān)聯(lián)X 蛋白；FOXO3a 為叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O 亞型；與對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

3 討論

高齡女性由于卵巢儲(chǔ)備功能低下，在獲得成功妊娠前不得不經(jīng)歷多次COS 以獲得足夠的優(yōu)質(zhì)胚胎。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)歷4 次以上COS 的小鼠生育能力明顯下降，抗苗勒管激素表達(dá)水平以及E2、P 濃度顯著降低[4]；影響卵丘細(xì)胞線粒體功能，從而降低卵巢功能，降低卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量，影響胚胎發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)中，與經(jīng)歷1 次COS 相比，經(jīng)歷4 次COS 的老齡雌性小鼠E2、P 及INHB 水平降低，表明連續(xù)COS 降低了小鼠的生殖內(nèi)分泌水平及卵巢儲(chǔ)備功能。卵巢病理圖片顯示，連續(xù)4 次COS 使小鼠的原始卵泡、竇卵泡及成熟卵泡均減少，并使卵巢顆粒細(xì)胞線粒體形態(tài)發(fā)生異常改變、影響了線粒體的功能。通過觀察我們發(fā)現(xiàn)，4次COS 雌性老齡模型小鼠異常卵子，尤其是破碎卵子的比率明顯增高，而其卵子內(nèi)ROS 水平也明顯增加。我們推測(cè)，重復(fù)COS 可能導(dǎo)致雌性老齡模型小鼠的生殖器官受到強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激和損傷。

JNK 也稱為應(yīng)激激活蛋白激酶（SAPK），參與各種應(yīng)激反應(yīng)，尤其是導(dǎo)致氧化損傷的應(yīng)激反應(yīng)[12]。已有研究表明，在ROS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，JNK 被激活并與p53 協(xié)同調(diào)節(jié)凋亡進(jìn)程；同時(shí)，JNK 可通過Bax的線粒體易位增強(qiáng)Bcl2 促凋亡家族成員的功能。在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激時(shí)，F(xiàn)OXO3a 磷酸化并促進(jìn)ROS 清除劑的表達(dá)，而促其磷酸化的許多激酶也可作為JNK通路的上游激酶誘導(dǎo)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)及應(yīng)激細(xì)胞的凋亡[13-14]。本研究顯示，由連續(xù)COS 導(dǎo)致的卵巢內(nèi)ROS 過度累積，可誘導(dǎo)卵巢JNK、Bax、p53 mRNA 表達(dá)增加，F(xiàn)OXO3a mRNA 表達(dá)減低。

本研究表明，經(jīng)過4 次COS 的老齡雌性小鼠雌孕激素水平下降、卵巢各級(jí)卵泡數(shù)減少，可能與卵巢內(nèi)過度ROS 積聚，卵巢氧化應(yīng)激水平激增，從而導(dǎo)致JNK、Bax、p53 等凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加，顆粒細(xì)胞線粒體形態(tài)異常、功能紊亂有關(guān)。