王 審 許銘明 葉紫恒 屠俊杰

心血管疾病是全球心臟病患者死亡的主要原因之一，具有高死亡率和高致殘率特性[1]。其中，再灌注是缺血性心血管疾病最有效的治療方法之一，但是缺血再灌注損傷會進一步加重心肌細胞死亡[2]。目前減少心肌缺血再灌注損傷的治療效果十分有限[3]。滌痰活血舒痹湯（Ditan Huoxue Shubi Decoction，DHS）在治療心臟疾病方面具有良好效果，其主要組成為瓜蔞皮、瓜蔞子、薤白和生丹參等。丹參、瓜蔞和薤白能通過抑制血小板聚集和抑制凝血功能等使血液黏稠度降低，提高心肌血氧供應(yīng)進而保護心臟[4-6]。DHS是否能夠緩解心肌缺血再灌注損傷鮮有相關(guān)報道。此外，microRNA（miRNA）與造血、細胞增殖和細胞凋亡等生理過程有關(guān)，例如miR-26a-5p 可通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT 通路來保護心肌缺血再灌注損傷[7]。研究顯示，瓜蔞丹參顆粒能夠通過上調(diào)miR-155 的表達來改善心臟疾病[8]。因此，本文深入研究DHS 通過調(diào)控miRNA 保護心肌缺血再灌注損傷的分子機制，為心肌缺血再灌注損傷患者提供新的治療手段。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞 30 只健康雄性SD 大鼠（8 周齡，240～260 g）購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，實驗動物使用許可證：SYXK（浙）2021-0012，倫理批號：IACUC-20210809-14，飼養(yǎng)環(huán)境通風良好，溫度、相對濕度適宜，12 h 光暗循環(huán)，大鼠均標準飼料喂養(yǎng)，不禁食水。胚胎大鼠心肌細胞H9c2 細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫（批號GNR5）。

1.2 藥物 DHS（瓜蔞皮、瓜蔞子各12 g，薤白10 g，姜半夏9 g，生川芎12 g，生丹參20 g，紅曲3 g，茯苓15 g 和紅景天12 g）購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院。

1.3 試劑 miR-NC（miRNA 陰性對照）、miR-148a 拮抗劑、OE-NC（過表達陰性對照）和硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）過表達質(zhì)粒由上海吉瑪生物公司構(gòu)建；Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）（批號5023）、B 淋巴細胞瘤2（Bcl-2）（批號3498）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）（批號9661）、TXNIP（批號14715）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅰ/3Ⅱ（LC3-Ⅰ/Ⅱ）（批號4108）、p62（批號23214）和Beclin-1（批號3495）購自美國Cell Signaling Technology 公司；CCK-8 試劑盒（批號CA1210）、TUNEL 試劑盒（批號T2190）和BCA 試劑盒（批號PC0020）等購自北京Solarbio 公司；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號B532453-0020）購于上海生工生物工程有限公司。

1.4 實驗儀器 酶標儀（型號：680）、實時熒光定量PCR 儀（型號：9600）和電泳儀（型號：1658001）購自美國Bio-Rad 公司；冷凍高速離心機（型號：Sorvall Legend Micro）購自美國Thermo 公司；熒光倒置顯微鏡（型號：CKX53）購自日本Olympus 公司。

2 實驗方法

2.1 DHS 及大鼠血清制備（1）DHS 制備：將藥材加入450 mL 水浸泡30 min，煮沸后文火慢煎40 min并趁熱過濾；二煎加270 mL 水，文火慢煎40 min 并趁熱過濾，合并2 次濾液并濃縮備用。（2）“血瘀”型大鼠模型建立：首先給大鼠腹腔注射維生素D3 70萬IU/kg，分3 次，每2 d 注射1 次，然后各組每日每只給予高脂飼料20 g，連續(xù)喂飼2 周。（3）血清制備：“血瘀”型大鼠用1 mL DHS 水煎液[1 mL/100g，含生藥材劑量為9 g/（kg·d）]早晚各灌胃1 次，實驗過程中大鼠自由飲食且每天灌胃，共8 d。然后，采集大鼠的全血并在4 ℃下靜置30 min，經(jīng)離心、過濾、水浴和滅活后獲得大鼠含藥血清。同時，對照組SD 大鼠灌胃蒸餾水（1 mL），其血清用作對照組即大鼠空白血清。最后儲存在-20°C 冰箱中備用。

2.2 細胞模型制備 將大鼠心肌細胞H9c2 在DMEM 培養(yǎng)基中于37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后，將H9c2 細胞在37 ℃、0.1% O2、5% CO2和95% N2的缺氧條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨后H9c2細胞在5% CO2和95%空氣的復(fù)氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，構(gòu)建心肌細胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型[9]。對照組為正常培養(yǎng)的H9c2 細胞。

2.3 CCK-8 檢測 按照CCK-8 試劑盒說明書檢測H9c2 細胞增殖情況，將H9c2 細胞（5×103/孔）接種于96 孔板中，按相應(yīng)條件處理后加入CCK-8 溶液培養(yǎng)4 h，去上清后加入DMSO 溶解，通過酶標儀檢測450 nm 處的OD 值。H9c2 細胞活性（%）=（實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。

2.4 TUNEL 染色 將H9c2 細胞（1×106/mL）接種到96 孔板中，使用4%多聚甲醛固定液固定H9c2 細胞30 min，加入0.2% Triton X-100 孵育10 min。然后，用PBS 緩沖液清洗H9c2 細胞3 次后，將H9c2 細胞與TUNEL 溶液在37 ℃下孵育60 min，并用DAPI 處理H9c2 細胞。最后，在熒光顯微鏡下觀察染色的H9c2 細胞。

2.5 Western blot 檢測 通過裂解液裂解H9c2 細胞，通過BCA 試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PDVF 膜中，用5%脫脂牛奶密閉1 h 后并與一抗（Bax，1∶1000；Bcl-2，1∶1000；cleaved caspase-3，1 ∶1000；TXNIP，1 ∶500；LC3-Ⅰ/Ⅱ，1 ∶1000；p62，1 ∶1000；Beclin-1，1∶000；β-actin，1∶1000）在4 ℃過夜，后與二抗山羊抗兔IgG（1∶2000）反應(yīng)1 h，隨后通過ECL 顯色來獲取顯色蛋白條帶。

2.6 qRT-PCR 檢測 運用Trizol 試劑獲取H9c2 細胞的總RNA，利用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，miR-148a 通過miRNA 熒光定量PCR 試劑盒進行qRT-PCR 檢測。以U6 為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法計算miR-148a 的相對表達水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：miR-148a F：5'-GCGCGTCAGTGCACTACAGA-3'，R：5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'；U6 F：5'-AACGCTTACGAATTTGCGT-3'，R：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)運用GraphPad Prism 8.0 軟件統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 miR-148a 在體外H/R 細胞模型表達下調(diào) 與對照組比較，H/R 組H9c2 細胞活力顯著降低（P<0.01）；H9c2 細胞凋亡水平顯著上升，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 下調(diào)而促凋亡蛋白Bax 和cleaved caspase-3 的表達水平顯著上調(diào)。自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1 的表達水平顯著增加而p62 表達降低。H/R組miR-148a 表達下調(diào)（P<0.05）。見表1，圖1。

圖1 miR-148a 在體外H/R 細胞模型表達

表1 各組H9c2 細胞活力和miR-148a 相對表達水平比較（）

表1 各組H9c2 細胞活力和miR-148a 相對表達水平比較（）

注：對照組為正常培養(yǎng)的H9c2 細胞；H/R 組為缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細胞；與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

3.2 DHS 上調(diào)miR-148a 表達減輕心肌缺血再灌注損傷 與H/R+空白血清組比較，H/R+含藥血清組miR-148a 表達上調(diào)（P<0.01），H9c2 細胞活力顯著增加（P<0.01），細胞凋亡水平顯著下降。見表2，圖2。

圖2 DHS 上調(diào)miR-148a 表達減輕H/R 細胞損傷

表2 各組miR-148a 相對表達水平和H9c2 細胞活力比較（）

表2 各組miR-148a 相對表達水平和H9c2 細胞活力比較（）

注：H/R+空白血清組為大鼠空白血清處理H/R 組細胞；H/R+含藥血清組為大鼠含藥血清處理H/R 組細胞；H/R 為缺氧/復(fù)氧；與H/R+空白血清組比較，aP<0.01

3.3 DHS 通過miR-148a 調(diào)控TXNIP 表達 與H/R+空白血清組比較，H/R+含藥血清組miR-148a 表達上調(diào)，通過miR-148a 拮抗劑可降低miR-148a 水平（P<0.01）。與H/R+空白血清組比較，H/R+含藥血清組TXNIP 表達下調(diào)；而進一步加入miR-148a 拮抗劑，細胞中的TXNIP 表達顯著上調(diào)。見表3，圖3。

圖3 DHS 通過miR-148a 來調(diào)控TXNIP 蛋白表達

表3 各組miR-148a 相對表達水平比較（）

表3 各組miR-148a 相對表達水平比較（）

注：H/R+空白血清組為大鼠空白血清處理H/R 組細胞；H/R+含藥血清組為大鼠含藥血清處理H/R 組細胞；H/R+含藥血清+miR-NC 組為轉(zhuǎn)染miR-NC 的H/R+含藥血清組細胞；H/R+含藥血清+miR-148a 拮抗劑組為轉(zhuǎn)染miR-148a 拮抗劑的H/R+含藥血清組細胞；與H/R+空白血清組比較，aP<0.01；與H/R+含藥血清+miR-NC 組比較，bP<0.01

3.4 DHS 通過miR-148a 調(diào)控TXNIP 表達降低自噬和凋亡水平 與H/R+空白血清組比較，H/R+含藥血清組的TXNIP 表達下調(diào)；而與H/R+含藥血清+OENC 組比較，H/R+含藥血清+TXNIP 過表達質(zhì)粒組的TXNIP 表達顯著上調(diào)。與H/R+空白血清組比較，H/R+含藥血清組的自噬水平顯著下降；與H/R+含藥血清+OE-NC 組比較，H/R+含藥血清+TXNIP 過表達質(zhì)粒組自噬水平顯著上升。與H/R+空白血清組比較，H/R+含藥血清組的H9c2 細胞活力升高（P<0.01），細胞凋亡減少；與H/R+含藥血清+OE-NC 組比較，H/R+含藥血清+TXNIP 過表達質(zhì)粒組的H9c2 細胞活力降低（P<0.05），細胞凋亡增加。見表4，圖4。

圖4 DHS 通過miR-148a 調(diào)控TXNIP 表達降低自噬和凋亡水平

表4 各組H9c2 細胞活力比較（%，）

表4 各組H9c2 細胞活力比較（%，）

注：H/R+空白血清組為大鼠空白血清處理H/R 組細胞；H/R+含藥血清+OE-NC 組為轉(zhuǎn)染OE-NC 的H/R+含藥血清組細胞；H/R+含藥血清+TXNIP 過表達質(zhì)粒組為轉(zhuǎn)染TXNIP 過表達質(zhì)粒的H/R+含藥血清組細胞；H/R 為缺氧/復(fù)氧；TXNIP 為硫氧還蛋白互作蛋白；與H/R+空白血清組比較，aP<0.01；與H/R+含藥血清+OE-NC 組比較，bP<0.05

4 討論

心肌缺血再灌注損傷通常是心肌缺血后供血恢復(fù)而誘發(fā)的細胞損傷，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[10]。有研究表明，瓜蔞對缺血缺氧心肌細胞具有保護作用[6]。同時，與DHS 主要成分相同的瓜蔞薤白半夏湯對缺血缺氧損傷的心肌細胞具有顯著的保護作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，DHS 能夠降低體外H/R 細胞模型的細胞凋亡水平。

miRNA 與心血管疾病的發(fā)病有關(guān)，miR-146a 能夠通過抑制NOX4 信號傳導(dǎo)來防止心肌缺血再灌注損傷[12]。二甲雙胍可調(diào)節(jié)miR-148a 來保護缺血/再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷[13]。DHS 主要成分瓜蔞和丹參通過調(diào)控miR-155 的表達來改善心臟疾病，瓜蔞薤白半夏湯可以通過調(diào)控miRNA 治療冠心病[7，14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a 在體外H/R 細胞模型中表達下調(diào)，進一步實驗證實DHS 能夠上調(diào)miR-148a 表達來降低體外H/R 細胞模型的細胞凋亡水平。

最后，本文在分析DHS 的作用機制上發(fā)現(xiàn)，DHS通過miR-148a 調(diào)控TXNIP 的表達來降低自噬水平進而緩解H/R 細胞損傷。已有研究表明，miRNA 通過抑制TXNIP 介導(dǎo)的心肌細胞焦亡來減輕大鼠心肌損傷[15]。更有證據(jù)表明，miR-148a 能夠通過抑制TXNIP 表達來改善心肌缺血再灌注損傷[9]。過度自噬能夠引起心臟損傷和細胞死亡，而TXNIP 能夠調(diào)節(jié)自噬從而在急性缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[16]。DHS 主要成分瓜蔞和薤白可以調(diào)節(jié)自噬水平抑制動脈粥樣硬化[17]。這些報道都驗證了DHS 能通過miR-148a 調(diào)控TXNIP 的表達來降低自噬水平進而緩解心肌缺血再灌注損傷。

綜上所述，DHS 通過調(diào)控miR-148a/TXNIP 降低心肌細胞的自噬和凋亡水平進而緩解心肌缺血再灌注損傷。