李晶津 王佳玉 金澤寧

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 (北京， 100070)

肝臟是膽固醇代謝的重要器官，而膽固醇的水平是影響動(dòng)脈粥樣硬化疾病的重要因素，臨床上治療動(dòng)脈粥樣硬化的基石藥物他汀類藥物，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶，阻斷細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，抑制肝臟合成膽固醇[1]。晝夜節(jié)律系統(tǒng)是一種進(jìn)化上保守的計(jì)時(shí)機(jī)制，控制哺乳動(dòng)物每日的行為和生理節(jié)律，使之與外環(huán)境計(jì)時(shí)同步，以確保機(jī)體保持最佳的適應(yīng)能力[2]。臟器的時(shí)鐘節(jié)律由轉(zhuǎn)錄激活因子(CLOCK/BMAL1)和抑制因子(PER/CRY)組成的轉(zhuǎn)錄/翻譯負(fù)反饋環(huán)驅(qū)動(dòng)，并調(diào)節(jié)參與關(guān)鍵細(xì)胞功能的基因的節(jié)律性表達(dá)[3，4]。有研究報(bào)道，晝夜節(jié)律與肝臟相關(guān)脂代謝密切相關(guān)，CLOCK可節(jié)律性調(diào)控肝臟中甘油三酯水平 ，肝臟中敲除BMAL1后表現(xiàn)出能量代謝的紊亂及氧化損傷的累積[5，6]。本研究旨在通過(guò)生物信息的分析，研究晝夜節(jié)律對(duì)肝臟膽固醇代謝的影響，探討晝夜節(jié)律通過(guò)膽固醇代謝調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)搜索關(guān)鍵字“晝夜節(jié)律”“小鼠”“肝臟組織”“飲食干預(yù)”“晝夜節(jié)律基因調(diào)節(jié)”獲取相關(guān)研究樣本數(shù)據(jù)。GSE52333檢測(cè)樣本數(shù)36(高脂飲食小鼠vs正常飲食小鼠)[7]，GSE70497檢測(cè)樣本數(shù)24(晝夜節(jié)律基因Artnl敲除型小鼠vs野生型小鼠)[8]。

1.2 生物信息學(xué)分析 利用CirGRDB獲得具有晝夜節(jié)律的基因表達(dá)譜[9]，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)檢索膽固醇代謝通路相關(guān)基因[10]，篩選出具有節(jié)律性的肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0.1軟件處理，結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Lomb-Scargle 周期表算法預(yù)測(cè)時(shí)間序列的周期性(LSPR)分析方法獲得相關(guān)基因的晝夜節(jié)律顯著性(P值)、晝夜節(jié)律振幅(amplitude)、晝夜節(jié)律時(shí)相(即節(jié)律的波峰點(diǎn)，phase)[11]。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟晝夜節(jié)律表達(dá)基因譜分析 通過(guò)生物信息學(xué)分析兩組芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠肝臟中具有晝夜節(jié)律的基因有3 337個(gè)，晝夜節(jié)律基因Artnl敲除型小鼠肝臟中具有晝夜節(jié)律的基因有1 832個(gè)。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中膽固醇代謝通路涉及49個(gè)基因，通過(guò)韋恩圖分析，上述具有晝夜節(jié)律的基因中有8個(gè)基因參與膽固醇代謝通路。見(jiàn)圖1。

圖1 肝臟組織中晝夜節(jié)律表達(dá)的膽固醇代謝相關(guān)基因篩選

2.2 小鼠肝臟中晝夜節(jié)律表達(dá)的膽固醇代謝相關(guān)基因分析 小鼠肝臟中晝夜節(jié)律表達(dá)的膽固醇代謝相關(guān)基因包括內(nèi)皮脂肪酶(LIPG)、中性膽固醇水解酶1(NCEH1)、人血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)、溶酶體酸性脂肪酶(LIPA)、尼曼-匹克C1型蛋白(NPC1)、ATP結(jié)合盒蛋白B11(ABCB11)、ATP結(jié)合盒蛋白G5(ABCG5)、ATP結(jié)合盒蛋白G8(ABCG8)，在膽固醇代謝通路中的主要功能包括膽固醇合成、膽固醇排泄、膽汁酸排泄、抑制脂蛋白脂解酶。振幅、時(shí)相、P值等晝夜節(jié)律數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 小鼠肝臟中膽固醇代謝相關(guān)基因的晝夜節(jié)律數(shù)據(jù)

2.3 小鼠肝臟中膽固醇代謝相關(guān)基因晝夜節(jié)律表達(dá)特征 通過(guò)分析上述膽固醇代謝相關(guān)基因的節(jié)律性，發(fā)現(xiàn)其晝夜表達(dá)特征。正常飲食小鼠肝臟中LIPG、NCEH1、ANGPTL4、NPC1、ABCG5、ABCG8的表達(dá)量在光周期下逐漸增加、中午達(dá)到峰值，隨后在暗周期下逐漸降低；LIPA、ABCB11的表達(dá)量則在光周期下逐漸減少，中午降至最低，隨后在暗周期下逐漸增多。與之相比，高脂飲食可增加相關(guān)基因的表達(dá)量，但不影響晝夜節(jié)律性，見(jiàn)圖2。芳基烴受體核易位樣蛋白1(Artnl)也被稱為BMAL1，是晝夜節(jié)律系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子，敲除Artnl基因后，小鼠肝臟膽固醇代謝基因表達(dá)的晝夜節(jié)律消失，見(jiàn)圖3。

圖2 小鼠肝臟中膽固醇代謝相關(guān)基因晝夜節(jié)律表達(dá)特征 (·為正常飲食組，■為高脂飲食組)

圖3 Arntl基因敲除小鼠肝臟中膽固醇代謝基因的晝夜表達(dá)節(jié)律消失 (·為野生型組，■為Arntl基因敲除組)

3 討論

膽固醇既是細(xì)胞生物膜的構(gòu)成成分，又是類固醇類激素、膽汁酸及維生素D的前體物質(zhì)，膽固醇代謝失調(diào)能夠引起多種疾病，血漿膽固醇水平增高是引起動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素，可引起一系列心血管疾病。肝臟是膽固醇合成的主要場(chǎng)所，也是將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的主要器官，在膽固醇的代謝過(guò)程中起到重要作用。肝臟是所有類型脂質(zhì)的主要代謝器官，主要通過(guò)調(diào)節(jié)脂蛋白合成、脂質(zhì)攝取和轉(zhuǎn)化、脂肪酸的從頭合成和氧化來(lái)參與脂質(zhì)代謝過(guò)程。肝臟的代謝功能受晝夜節(jié)律的影響較大，現(xiàn)代生活晝夜節(jié)奏不規(guī)律，夜間熬夜現(xiàn)象嚴(yán)重，晝夜節(jié)律紊亂導(dǎo)致代謝綜合征[12]，有報(bào)道晝夜節(jié)律控制因子敲出后導(dǎo)致膽固醇代謝紊亂[13]。小鼠肝臟中敲除REV-ERB-α和REV-ERB-β可調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因[14]，相關(guān)分子機(jī)制在肝臟起到調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的作用[15]。

本研究通過(guò)芯片數(shù)據(jù)挖掘和生物信息學(xué)分析，探索晝夜節(jié)律對(duì)肝臟膽固醇代謝的影響，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟部分膽固醇代謝相關(guān)基因表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性，LIPG、NCEH1、ANGPTL4、NPC1、ABCG5、ABCG8的表達(dá)量在光周期下逐漸增加、中午達(dá)到峰值，隨后在暗周期下逐漸降低；LIPA、ABCB11的表達(dá)量則在光周期下逐漸減少，中午降至最低，隨后在暗周期下逐漸增多。整體的晝夜節(jié)律表現(xiàn)出與生理相關(guān)的晝夜節(jié)律特性，白天進(jìn)食后，相關(guān)合成排泄的高峰較為集中，因此協(xié)調(diào)的晝夜節(jié)律能夠保持相關(guān)膽固醇代謝的穩(wěn)態(tài)，統(tǒng)一協(xié)調(diào)整個(gè)代謝過(guò)程。而敲除晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)因子后，相關(guān)節(jié)律消失，整個(gè)代謝的過(guò)程無(wú)法根據(jù)機(jī)體的整體晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)波峰波谷，從而影響膽固醇代謝。

LIPG在肝、肺、腎和胎盤中均可表達(dá)，是甘油三酯脂肪酶家族的成員，具有磷脂酶活性，參與高密度脂蛋白代謝，進(jìn)而參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控[16]。NCEH1主要分布在脂肪和肝臟細(xì)胞中，是一種重要絲氨酸水解酶，參與膽固醇脂、脂肪酸酯的水解代謝，在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮限速作用，在人類動(dòng)脈粥樣斑塊區(qū)大量表達(dá)，也有研究報(bào)道NCEH1相關(guān)的脂質(zhì)代謝異常與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)[17]。ANGPTL4屬于分泌型糖蛋白，是血管生成素樣蛋白家族成員，在腸道、脂肪、肌肉和肝臟等多種組織廣泛表達(dá)，與動(dòng)物脂肪代謝密切相關(guān)，主要通過(guò)抑制脂蛋白脂酶活性參與脂質(zhì)代謝調(diào)控，具有促進(jìn)脂解和脂肪酸氧化分解、減少脂肪沉積并刺激脂肪動(dòng)用的作用[18]。LIPA又稱酸性膽固醇酯水解酶，是脂蛋白代謝中的水解酶之一，早在20世紀(jì)60年代人們就發(fā)現(xiàn)，LIPA突變會(huì)導(dǎo)致多種組織內(nèi)的脂質(zhì)堆積。NPC1是一種膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，NPC2能夠從細(xì)胞內(nèi)富含膽固醇的低密度脂蛋白中抽提膽固醇，然后傳遞給細(xì)胞膜上的NPC1，進(jìn)而將膽固醇通過(guò)下游蛋白傳遞至細(xì)胞的其他部位[19]。ABCB11是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，其蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)方式整合了底物濃度梯度擴(kuò)散和ATP水解供能的主動(dòng)運(yùn)輸，膽固醇在肝細(xì)胞中合成并代謝為膽汁酸鹽，然后由ABCB11外排至膽小管，參與膽汁形成，幫助消化脂類和脂溶性維生素[20]。ABCG5和ABCG8都是依賴于ATP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC家族G亞家族成員，在小腸和肝臟高表達(dá)，二者在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裝配為二聚體后轉(zhuǎn)運(yùn)定位于質(zhì)膜頂端，促進(jìn)膽固醇排泄至膽汁[21]。這些節(jié)律表達(dá)的膽固醇代謝相關(guān)基因與代謝相關(guān)疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化有著緊密聯(lián)系，ABCG5和ABCG8的高表達(dá)也能減少高血脂導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[22]，NCEH1、ANGPTL4和NPC1敲出后均密切影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成[23-25]。

研究結(jié)果提示，肝臟膽固醇代謝部分基因表達(dá)具有晝夜節(jié)律性，并在動(dòng)脈粥樣硬化病變過(guò)程起潛在作用。本研究也存在不足之處，晝夜節(jié)律影響肝臟膽固醇代謝的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。