楊春發(fā)，劉勝超，王金帥，趙德萍，雷霞，崔云甫

1.雙鴨山雙礦醫(yī)院普外科，黑龍江 雙鴨山 155100；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 155000；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科，黑龍江 哈爾濱 155000

術(shù)后高凝狀態(tài)導(dǎo)致肺栓塞是胃癌病人重要死因之一[1-2]。使用低分子肝素預(yù)防性抗凝治療可降低血栓發(fā)生率，但明顯增加出血、切口感染等并發(fā)癥的發(fā)生率[4-5]，且仍常有致命性血栓事件發(fā)生[3]。探討胃癌病人術(shù)后高凝狀態(tài)形成機(jī)制，發(fā)現(xiàn)精準(zhǔn)抗凝靶點(diǎn)，對改善胃癌病人生存質(zhì)量具有重大意義。

中性粒細(xì)胞外捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是一種新型中性粒細(xì)胞死亡方式，由細(xì)胞外DNA構(gòu)成主要骨架，周圍附著中性粒細(xì)胞相關(guān)蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[6]。除具有殺菌作用外，在凝血系統(tǒng)激活、血栓形成過程中起著重要作用[7-10]。腫瘤、炎癥、免疫反應(yīng)可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放NETs[11-14]，因此我們檢測胃癌病人術(shù)前、術(shù)后血液中NETs形成情況，并評估其促凝功能，闡明NETs在胃癌術(shù)后高凝狀態(tài)形成中的作用。現(xiàn)將本研究結(jié)果報(bào)告如下。

資料與方法

一、研究對象

選取2018年4月至2021年6月在雙鴨山雙礦醫(yī)院普外科行腹腔鏡輔助胃癌根治手術(shù)病人21例，并收集21名健康志愿者作為對照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：<18歲，病人有急慢性感染、血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、肝腎功能障礙，或者合并其他腫瘤、血小板或凝血功能障礙，服用抗凝或抗血小板藥物者[11]。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批件號:2018-01(省)]，所有病人均簽署知情同意書。

二、方法

1.無血小板血漿、中性粒細(xì)胞準(zhǔn)備 通過兩部離心方法準(zhǔn)備無血小板血漿，中性粒細(xì)胞利用Percoll密度離心法準(zhǔn)備，詳見文獻(xiàn)[11]。

2.NETs生成情況檢測 通過改良ELISA法檢測髓過氧化物酶-DNA復(fù)合體(MPO-DNA)來評估NETs生成情況，詳見文獻(xiàn)[11]。

3.體外NETs形成實(shí)驗(yàn) 正常人中性粒細(xì)胞(1×106)在37 °C， 5%二氧化碳條件下，分別加入磷酸鹽緩沖液稀釋的正常人血漿、病人術(shù)后血漿(濃度為1∶50)孵育3 h。通過改良酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測NETs生成情況。利用免疫熒光顯微鏡進(jìn)一步觀察中性粒細(xì)胞釋放NETs情況，方法同文獻(xiàn)[11] 。

4.凝血功能檢測 利用DNA酶-1分解NETs，通過ELISA法檢測凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(thrombin-antithrombin complex，TAT)來間接評估NETs促凝功能，方法同文獻(xiàn)[11]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胃癌病人手術(shù)前后和正常人臨床資料比較

21例病人包括TNM分期Ⅱ期5例，Ⅲ期16例，與對照組比較，年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)； 但凝血指標(biāo)D-二聚體、TAT及NETs水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；胃癌病人術(shù)后TAT、D-二聚體、NETs水平與術(shù)前相比均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

二、體外培養(yǎng)中性粒細(xì)胞生成NETs情況

免疫熒光雙標(biāo)顯示，胃癌病人術(shù)后血漿刺激組NETs(MPO-DNA復(fù)合體)陽性細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組(圖1A、B)。對生成NETs的中性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)量化后，統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)后病人血漿刺激組NETs含量顯著高于對照組，陽性細(xì)胞百分比顯著升高(6.930±1.832比3.190±0.637，P<0.01，圖1C)。在酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測，與對照組相比，術(shù)后病人血漿刺激組中性粒細(xì)胞MPO-DNA吸光度值也顯著升高(0.381±0.117比0.213±0.053，P<0.01，圖1D)。

三、NETs與胃癌病人術(shù)后血漿高凝狀態(tài)的相關(guān)性

為進(jìn)一步檢測NETs的促凝功能，我們在體外利用DNA酶-1處理胃癌術(shù)后病人外周血漿后，發(fā)現(xiàn)TAT生成量明顯下降[(1 008.35±359.52)ng/L比(675.16±167.89) ng/L，P<0.001](圖2)， 但與對照組[(381.037±69.536) ng/L]比較仍顯著升高(P<0.001，圖2)。

表1 胃癌病人手術(shù)前后和正常人臨床資料比較

注：MPO.髓過氧化酶；對照組為正常人血漿干預(yù)組，術(shù)后血漿組刺激組為胃癌術(shù)后病人血漿干預(yù)組。圖1 胃癌術(shù)后血漿促進(jìn)NETs生成 A、B.DNA(綠色)和MPO(紅色)免疫熒光標(biāo)記典型圖片，MPO與DNA共定位為釋放NETs的中性粒細(xì)胞(Merged圖中紅色箭頭所示)，比例尺：50 μm；C.中性粒細(xì)胞中髓過氧化酶-DNA復(fù)合體(MPO-DNA)陽性細(xì)胞數(shù)百分比(aP<0.01)；D.MPO-DNA復(fù)合體A450值(bP<0.01)。

注：TAT.凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物；對照組為正常人血漿，術(shù)后組為術(shù)后病人血漿，DNA酶-1組為采用DNA酶-1對術(shù)后病人血漿進(jìn)行干預(yù)；與對照組相比，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，aP<0.01；與術(shù)后組相比，采用配對t檢驗(yàn)，bP<0.01。圖2 DNA酶-1對胃癌病人術(shù)后血漿生成凝血酶-抗凝血酶原復(fù)合物的影響

討 論

炎癥、腫瘤、免疫等多種因素可以誘導(dǎo)NETs形成[12]。我們利用病人術(shù)后的血漿刺激正常人中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NETs生成明顯增加，說明病人術(shù)后體內(nèi)存在促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放NETs的成分。我們既往研究[11]發(fā)現(xiàn)胃癌病人的中性粒細(xì)胞容易釋放NETs。Cools-Lartigue等[13]與Najmeh等[14]分別在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)術(shù)后炎癥反應(yīng)是腫瘤小鼠術(shù)后NETs升高的原因。Demers等[15]發(fā)現(xiàn)帶瘤小鼠受到二次刺激后或合并感染時(shí)NETs生成明顯增加，并有促凝、促進(jìn)血栓形成作用。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了我們的結(jié)論即胃癌病人術(shù)后NETs生成增加，并促進(jìn)高凝狀態(tài)形成。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示NETs能夠促進(jìn)胃癌病人術(shù)后高凝狀態(tài)形成，但結(jié)果還顯示利用DNA酶-1處理胃癌病人術(shù)后血漿并不能使TAT生成量下降到與對照組相似的程度。 Boone 等[16]發(fā)現(xiàn)NETs可通過激活血小板、釋放組織因子等途徑促進(jìn)胰腺癌高凝狀態(tài)形成。因此NETs促進(jìn)胃癌病人術(shù)后高凝狀態(tài)形成機(jī)制需進(jìn)一步行體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)來闡明。

綜上所述，NETs升高可能是誘導(dǎo)胃癌病人術(shù)后高凝狀態(tài)形成的原因之一。降解或抑制NETs表面的DNA功能有望改善胃癌病人術(shù)后高凝狀態(tài)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突