馬琳琳,劉 珍,馬騰州,清 江,田衍香,丁 利*

(1.長(zhǎng)沙理工大學(xué) 化學(xué)與食品工程學(xué)院,長(zhǎng)沙 410114; 2.長(zhǎng)沙和合醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司,長(zhǎng)沙 410000;3.上海海關(guān)工業(yè)品與原材料檢測(cè)技術(shù)中心,上海 200135)

蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌,是引起食物中毒的食源性致病菌之一,其污染食品后,在合適的條件下菌體能快速進(jìn)行繁殖并產(chǎn)生大量的毒素,從而導(dǎo)致人食物中毒[1],且在蔬菜、肉、乳制品、炒米飯以及各種甜點(diǎn)等[2]多種食品中分離出該菌株。蠟樣芽孢桿菌含有多種可引起嘔吐或腹瀉的食物中毒基因[3-6],其中ces基因產(chǎn)生的嘔吐型毒素能夠轉(zhuǎn)化為活性毒素吸附在內(nèi)臟上;腹瀉型毒素大多由腸毒素F M(ent F M)、腸毒素T(bce T)、細(xì)胞毒素K(cyt K)、溶血性素hbl和非溶血素nhe等基因共同作用[7]。蠟樣芽孢桿菌還會(huì)通過(guò)菌體感染導(dǎo)致眼部疾病、心內(nèi)膜炎、肺炎、敗血癥及腦膜炎等,嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致暴發(fā)性肝臟衰竭。因此,建立快速準(zhǔn)確檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌以控制其污染、減少毒素危害等[2,8-11]具有重要意義。

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)主要有傳統(tǒng)檢測(cè)方法[12]、免疫學(xué)檢測(cè)方法[13-14]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增檢測(cè)[15-16]等。其中,傳統(tǒng)檢測(cè)方法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.14-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》規(guī)定的微生物培養(yǎng)法,如文獻(xiàn)[17]用自制顯色培養(yǎng)基解決蠟樣芽孢桿菌鑒別和計(jì)數(shù)的困難,但試驗(yàn)周期較長(zhǎng)(3～5 d),不能滿足突發(fā)的食品安全以及檢驗(yàn)時(shí)效性的要求;文獻(xiàn)[18]采用生化鑒定與PCR相結(jié)合的方法從環(huán)境中分離鑒定蠟樣芽孢桿菌,結(jié)果較準(zhǔn)確,但該方法操作步驟復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)。免疫學(xué)檢測(cè)方法通過(guò)抗原和抗體特異性識(shí)別結(jié)合后形成復(fù)合物,從而對(duì)抗原抗體進(jìn)行檢測(cè),如文獻(xiàn)[19]采用酶聯(lián)免疫技術(shù)對(duì)鞭毛血清型蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行分類,具有高靈敏度和較強(qiáng)特異性;文獻(xiàn)[20]采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌,能有效檢出多種病原體的蠟樣芽孢桿菌;文獻(xiàn)[21]報(bào)道采用免疫磁珠技術(shù)能有效檢出熟制食品中蠟樣芽孢桿菌,但試劑耗材較貴,且存在抗體對(duì)蠟樣芽孢桿菌親和力低的現(xiàn)象。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用,如文獻(xiàn)[22]以Plc R和cyt K為目標(biāo)基因,采用PCR技術(shù)鑒定出蠟樣芽孢桿菌,該方法簡(jiǎn)單但不準(zhǔn)確;文獻(xiàn)[23]采用單疊氮丙啶多重PCR(PMA-mPCR)技術(shù)同時(shí)檢測(cè)出蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌和阪崎腸桿菌,該方法具有良好的特異性和靈敏度,但同時(shí)擴(kuò)增多對(duì)引物和不同模板需要嚴(yán)格的反應(yīng)條件,易引起非特異性擴(kuò)增,而且單疊氮丙啶對(duì)人體具有一定的致畸性;文獻(xiàn)[24]等采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)牛乳中蠟樣芽孢桿菌,檢出限低且操作簡(jiǎn)單,但對(duì)引物要求高且有假陽(yáng)性;文獻(xiàn)[2]等應(yīng)用探針建立實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)肉中蠟樣芽孢桿菌,檢測(cè)靈敏度為1×103CFU·mL-1,但探針昂貴,不適合大批量應(yīng)用檢測(cè)。

本工作以蠟樣芽孢桿菌gyr B為目標(biāo)基因,采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),應(yīng)用分段擴(kuò)增方式建立快速檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法,進(jìn)一步對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行考察,并應(yīng)用在實(shí)際樣本的檢測(cè)中,為快速、準(zhǔn)確、有效檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

9600A型Real-Ti me PCR儀;ZQPWI-70型 全溫振蕩培養(yǎng)箱。

LB肉 湯 干 粉(貨 號(hào)PM0010-500 g)、SYBR GREEN I(1 mL/管);細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒(BSC09S1B);蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等菌株及引物均購(gòu)自某生物公司。

豆腐、米飯、鮮面條、米粉、炒飯、大米、甜酒、肉、土豆、紅薯、生菜、空心菜共12個(gè)樣本,均購(gòu)自當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)

以蠟樣芽孢桿菌gyr B作為目標(biāo)基因,以16S作為內(nèi)參基因,應(yīng)用Pri mer 5軟件分析并設(shè)計(jì)引物,如表1所示,所有引物均由某公司合成。引物經(jīng)短暫離心后,用雙蒸水稀釋至10μmo L·L-1,備用。

表1 引物序列Tab.1 Pri mer sequences

1.2.2 樣本處理

對(duì)樣本預(yù)處理并混勻(紅薯、土豆、豆腐、肉和生菜切成1 c m大小片段;鮮面條、米粉和空心菜切成約1 c m小段;甜酒重懸;米飯和炒飯分別拌勻),分別稱取5 g放至45 mL肉湯培養(yǎng)基中,于37℃以轉(zhuǎn)速200 r·min-1培養(yǎng)12～14 h,取1 mL菌液提取基因組DNA,按照1.2.3節(jié)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。

1.2.3 實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系(20μL):SYBR GREEN I(基體)10μL,gyr B-F 0.5μL,gyr B-R 0.5μL,DNA模板2μL,雙蒸水7μL。在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)過(guò)程中采用分步擴(kuò)增方式,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)階段,95℃變性15 s,50℃復(fù)性30 s,72℃延伸30 s,共45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的建立

以蠟樣芽孢桿菌gyr B-F、gyr B-R為引物,16S作為內(nèi)參基因,按照試驗(yàn)方法對(duì)蠟樣芽孢桿菌DNA模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè),重復(fù)3次。結(jié)果表明,應(yīng)用分段擴(kuò)增方式,所得結(jié)果具有明顯的S型擴(kuò)增曲線,且gyr B-F、gyr B-R引物具有較好的重復(fù)性,說(shuō)明對(duì)蠟樣芽孢桿菌快速檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立成功。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性分析

將蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌分別接種在LB肉湯培養(yǎng)基中,其中蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌于37℃以轉(zhuǎn)速200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～14 h,單增李斯特菌于25℃以轉(zhuǎn)速200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～14 h。采用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒分別提取上述細(xì)菌基因組DNA,以蠟樣芽孢桿菌為陽(yáng)性對(duì)照,沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等3種細(xì)菌作為陰性對(duì)照,應(yīng)用上述4種菌株DNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR,以驗(yàn)證蠟樣芽孢桿菌引物的特異性,每個(gè)模板重復(fù)3次,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的特異性試驗(yàn)Fig.1 Specificity test of real-ti me fluorescence PCR for detection of Bacill us cereus

結(jié)果表明,4種菌株中只有蠟樣芽孢桿菌所得結(jié)果具有S型擴(kuò)增曲線,其他3種菌株無(wú)擴(kuò)增曲線,說(shuō)明引物特異性高。

2.3 蠟樣芽孢桿菌DNA靈敏度試驗(yàn)及活菌檢出限

將蠟樣芽孢桿菌DNA逐級(jí)稀釋成0.000 01,0.000 1,0.001,0.01,0.1,1,10,100 mg·L-1等8個(gè)不同濃度水平,并分別作為模板進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。結(jié)果表明,實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的靈敏度可達(dá)0.01 mg·L-1。

將活化后的蠟樣芽孢桿菌菌種按10倍稀釋法稀釋成不同濃度水平,分別接種到固體培養(yǎng)基上平板涂布培養(yǎng),按照GB 4789.2-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)計(jì)算》進(jìn)行菌落計(jì)數(shù);同時(shí)分別取2 mL上述稀釋菌液提取DNA,采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)活菌檢出限,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 活菌檢出限Fig.2 Detection limit of live bacteria

結(jié)果顯示,蠟樣芽孢桿含菌量為8.9×107,8.9×106,8.9×105,8.9×104,8.9×103,8.9×102CFU·mL-1時(shí)均有擴(kuò)增曲線,低于8.98×102CFU·mL-1時(shí)無(wú)擴(kuò)增曲線,表明活菌檢出限為8.9×102CFU·mL-1。

2.4 樣本分析

豆腐、米飯、鮮面條、米粉、炒飯、大米、甜酒、肉、土豆、紅薯、生菜、空心菜等12個(gè)樣本,經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)后分別提取基因組DNA,以蠟樣芽孢桿菌菌株活化后提取DNA作為對(duì)照,采用建立的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn),各樣本的Ct值(從基線到指數(shù)增長(zhǎng)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù))見(jiàn)表2。其中,Ct值小于42,表示檢出蠟樣芽孢桿菌。

表2 各樣本的Ct值Tab.2 Ct value of each sample

結(jié)果表明:鮮面條的Ct值為15.61,說(shuō)明鮮面條樣本中蠟樣芽孢桿菌含量高,反映出蠟樣芽孢桿菌在潮濕的環(huán)境中容易增長(zhǎng);其次,大米的Ct值為19.35,說(shuō)明大米中含有一定量的蠟樣芽孢桿菌;甜酒的Ct值最大,為40.25,說(shuō)明甜酒滅菌不完全,存在少量蠟樣芽孢桿菌污染;其余樣本的Ct值在20.00～34.00內(nèi)。綜合上述數(shù)據(jù)說(shuō)明,該市場(chǎng)中銷售的產(chǎn)品存在一定蠟樣芽孢桿菌的污染,檢出率為100%。

本工作采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù),以分段擴(kuò)增方式檢測(cè)食品中的蠟樣芽孢桿菌,可在12～14 h內(nèi)完成,蠟樣芽孢桿菌DNA靈敏度可達(dá)到0.01 mg·L-1,活菌檢出限為8.9×102CFU·mL-1,與文獻(xiàn)[2]檢測(cè)肉制品中蠟樣芽孢桿菌結(jié)果相似,并且該方法適用于大批量樣品中蠟樣芽孢桿菌的快速篩查檢測(cè),具有較好的推廣應(yīng)用前景。同時(shí),本方法對(duì)餐飲食品及其他淀粉含量高的食品、乳制品等中蠟樣芽孢桿菌的篩查檢測(cè),也具有較高的實(shí)用推廣價(jià)值。