朱將偉,趙 燕,尹 君

(1.上海市浦東新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,上海 201202; 2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院,上海 200233)

使用殺菌劑是防治作物病害的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法,但殺菌劑在土壤、水體以及農(nóng)作物上的殘留仍然存在較大隱患[1]。許多殺菌劑的抑菌譜呈廣譜性,在殺滅病原微生物的同時也會抑制有益菌的生長,導(dǎo)致潛在的生態(tài)風(fēng)險。另外,許多目前正廣泛使用的殺菌劑雖然對人畜等哺乳動物毒性較低,但對于其他生物可能有較高的毒性,例如,苯醚甲環(huán)唑與戊唑醇屬低毒殺菌劑,但它們對魚類有較高的毒性,如果以殘留有苯醚甲環(huán)唑或戊唑醇的谷物作為原材料制作魚類飼料將會有較大的風(fēng)險,因此對谷物或其他農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)用殺菌劑殘留量進(jìn)行全面監(jiān)測就顯得十分重要[2-3]。

目前,殺菌劑的檢測方法種類繁多,主要可歸納為3大類:免疫檢測法、色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。免疫檢測法靈敏度較高,但穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較差,多用于快速檢測;色譜法應(yīng)用廣泛,但是當(dāng)同時檢測的化合物數(shù)量越多時,其對色譜分離的要求就越高,耗時也越久,另外,限于色譜上所連接的常規(guī)檢測器的局限性,陽性結(jié)果通常需要再次確認(rèn);而色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高、選擇性強(qiáng),檢測結(jié)果無需再次確認(rèn)[4]。

烯酰嗎啉、嘧霉胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、咪鮮胺和戊唑醇等6種殺菌劑是目前在糧食作物生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的殺菌劑,其殘留檢出率也相對較高。而目前用于殺菌劑檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)(或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn))只能用于一種或者一類殺菌劑的測定,例如,GB 23200.49-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》僅用于食品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的測定,而GB 23200.54-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》只能用于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量的測定。

針對上述問題,本工作用乙腈-二氯甲烷體系提取谷物樣品中的殘留殺菌劑,并經(jīng)C18固相萃取柱凈化,采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時測定烯酰嗎啉、嘧霉胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、咪鮮胺和戊唑醇等6種殺菌劑的殘留量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260/6430型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;OA-SYS型24位氮吹儀(帶控溫);HY-4型可調(diào)速多用途振蕩器;Supelclean LC-18 C18固相萃取柱(100 mg/3 mL),Oasis?HLB固 相 萃 取 柱(200 mg/6 mL),弗羅里硅土固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1:取適量的6種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度均為5.00 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1。同法配制質(zhì)量濃度均為1.00 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2。

殺菌劑烯酰嗎啉、嘧霉胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、咪鮮胺、戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于99.0%;乙腈、甲醇、二氯甲烷和甲酸均為色譜純,其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent C18色 譜 柱(100 mm×3.0 mm,1.8μL);柱溫30℃;進(jìn)樣量3.0μL;流量0.3 mL·min-1;流動相A為含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.5 min時,B為50%;0.5～6.0 min時,B由50%升至90%,保持2.0 min;8.0～11.0 min時,B由90%升至95%;11.0～13.0 min時,B由95%降至50%,保持2.0 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

對于觀察組，全身麻醉，患者取截石位行患側(cè)輸尿管逆行插入F6導(dǎo)管并留置導(dǎo)尿管。取俯臥位后。針對患者的腹部施以墊高處理，B超引導(dǎo)下完成目標(biāo)腎盞穿刺操作，通過穿刺針鞘，置入J型導(dǎo)絲，將患者皮膚切開后，順導(dǎo)絲針對患者的腎造瘺口展開擴(kuò)張操作，完成后置入F18一次性可撕開鞘。鞘內(nèi)置入F15 Wolf腎鏡，對結(jié)石進(jìn)行明確后開始鈥激光碎石操作并取石，能量設(shè)置2.0 J，頻率20 Hz。手術(shù)后輸尿管內(nèi)置入F7輸尿管支架管，腎盂內(nèi)留置F16造瘺管。

電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;干燥氣溫度325℃,干燥氣流量10 L·min-1;霧化壓力275.8 k Pa;采用多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,軟件自動選擇響應(yīng)高的子離子用于定量。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理

取1 000 g谷物樣品,人工去除谷物中肉眼可見的雜質(zhì),粉碎、混勻后備用。

準(zhǔn)確稱取10 g已粉碎的谷物樣品至250 mL窄口玻璃瓶中,加入100 mL乙腈,連續(xù)振蕩30 min,將乙腈提取液過濾至100 mL濃縮瓶中,在40℃水浴中濃縮至約5 mL。取100 mL 4 g·L-1氯化鈉溶液分3次溶解濃縮液,然后全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,再用50 mL二氯甲烷振蕩提取10 min(重復(fù)1次)。有機(jī)相層經(jīng)預(yù)先裝有無水硫酸鈉的漏斗過濾,濾液收集在濃縮瓶中,于40℃水浴中減壓濃縮至近干,殘渣用5 mL甲醇溶解,過C18固相萃取柱(C18固相萃取柱先用10 mL甲醇淋洗),用5 mL甲醇洗脫,將收集的全部洗脫液在氮吹儀下吹干[5-7],殘余物用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液定容至1 mL,用0.2μm濾膜過濾后按照儀器工作條件測定。

1.3.2 定性分析

相關(guān)樣品在相同的測定條件下進(jìn)行分析時,若樣品中檢出色譜峰的保留時間與某種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間一致,而且在扣除背景后所選擇的兩對離子對及豐度比也一致,即可認(rèn)為該樣品中殘留這種殺菌劑[8-9]。

1.3.3 定量分析

試驗采用基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定,以減小基質(zhì)對定量分析的影響,外標(biāo)法定量。取5 mL經(jīng)過柱洗脫的空白基質(zhì)溶液5份,氮吹至0.5 mL以下,分別加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2,用50%乙腈溶液定容,配制成質(zhì)量濃度為1.00,10.00,50.00,100.00,1 000.0μg·L-1的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

在殺菌劑殘留分析中常以乙腈、乙腈-二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、甲醇-丙酮等體系作為提取溶劑。試驗比較了上述4組提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明:以乙腈-二氯甲烷體系作為提取溶劑時,所得目標(biāo)物的回收率均在90.0%左右,并且提取物中雜質(zhì)比較少;使用其他3種提取溶劑時,所得目標(biāo)物的回收率波動較大,提取物中的雜質(zhì)也相對較多,會影響后續(xù)凈化處理。因此,試驗選擇乙腈-二氯甲烷體系作為提取溶劑。

2.2 固相萃取柱的選擇

2.3 流動相的選擇

在前期試驗中已經(jīng)充分認(rèn)識到在流動相(水相)中添加適量的甲酸和甲酸銨的必要性。甲酸能有效促進(jìn)離子化,甲酸銨能改善峰形和調(diào)節(jié)離子化水平;甲酸的體積分?jǐn)?shù)若高于0.1%時會提高基線噪聲,并造成靈敏度下降,甲酸銨的濃度若高于3 mmol·L-1時對基線的穩(wěn)定性也會產(chǎn)生負(fù)面影響。因此,流動相中水相選擇含有0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液。

試驗進(jìn)一步比較了乙腈-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液、甲醇-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液兩組流動相對目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果表明,采用乙腈-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液為流動相時,其質(zhì)譜響應(yīng)值較甲醇-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液為流動相時高17%～30%,且峰形與色譜分離效果均較好。因此,試驗最終選用乙腈-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液作為流動相。圖1為6種殺菌劑的總離子流色譜圖。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chro matogra m

2.4 工作曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以響應(yīng)更高的子離子作為定量子離子,以各殺菌劑的定量子離子響應(yīng)值對其相應(yīng)質(zhì)量濃度繪制工作曲線。結(jié)果表明,各殺菌劑的質(zhì)量濃度在1.00～1 000.0μg·L-1內(nèi)與其定量子離子響應(yīng)值呈線性關(guān)系,其他線性參數(shù)見表2。當(dāng)被測樣品中殺菌劑質(zhì)量濃度超出上述線性范圍時,可進(jìn)行稀釋或濃縮處理后再測定。

按3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)與檢出限Tab.2 Linearity par ameters and detection limits

2.5 精密度與回收試驗、方法比對

對兩組空白谷物樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,計算回收率及測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。同時,按照我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(GB 23200.46-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中嘧霉胺、嘧菌胺、腈菌唑、嘧菌酯殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》用于測定嘧霉胺;GB 23200.49-2016用于測定苯醚甲環(huán)唑;SN/T 2917-2011《出口食品中烯酰嗎啉殘留量檢測方法》用于測定烯酰嗎啉;SN/T 0519-2010《進(jìn)出口食品中丙環(huán)唑殘留量的檢測方法》用于測定丙環(huán)唑;NY/T 1456-2007《水果中咪鮮胺殘留量的測定 氣相色譜法》用于測定咪鮮胺;SN/T 1952-2007《進(jìn)出口糧谷中戊唑醇?xì)埩袅康臋z測方法 氣相色譜-質(zhì)譜法》用于測定戊唑醇)對這兩組加標(biāo)谷物樣品中各殺菌劑的殘留量進(jìn)行測定,比對結(jié)果見表3。

表3 精密度與回收試驗結(jié)果以及不同方法比對結(jié)果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery,and comparison results of different methods(n＝5)

結(jié)果表明:各殺菌劑的回收率為87.9%～96.5%,測定值的RSD為2.7%～6.8%;本法所得測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法所得結(jié)果基本相當(dāng)(P＞0.05,無顯著性差異)。說明方法準(zhǔn)確度高、精密度好。

本工作將谷物樣品中的殘留殺菌劑先用乙腈-二氯甲烷體系進(jìn)行提取,再經(jīng)C18固相萃取柱凈化,采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法進(jìn)行分析,能對谷物樣品中的多種殺菌劑殘留進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量檢測,其靈敏度和準(zhǔn)確度均較好。方法較GB 23200.46-2016、GB 23200.49-2016以 及SN/T 2917-2011等標(biāo)準(zhǔn)方法更為簡便,耗時也更短,并可同時測試多種不同類型的殺菌劑,各項技術(shù)參數(shù)也都能滿足測定工作的要求。