凌云杉,劉 仲

(1.山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院,山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬職業(yè)病醫(yī)院,濟(jì)南 250062;2.濟(jì)南市疾病預(yù)防控制中心,濟(jì)南 250021)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)又稱環(huán)境激素,是指一種外源性物質(zhì),人體攝入環(huán)境激素會(huì)對體內(nèi)正常分泌物質(zhì)的合成、釋放、運(yùn)轉(zhuǎn)代謝、結(jié)合等過程形成干擾,使內(nèi)分泌系統(tǒng)功能受到激活或抑制,從而破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[1-3]。大量流行病學(xué)資料和臨床研究表明,生殖障礙、發(fā)育異常、代謝紊亂及某些癌癥的發(fā)生與環(huán)境激素有密切的關(guān)系[4]。在工業(yè)化發(fā)展迅速的今天,發(fā)現(xiàn)越來越多的物質(zhì)屬于環(huán)境激素,這些物質(zhì)分布在人們?nèi)粘Ｉ畹姆椒矫婷?特別是從事部分職業(yè)的人群很容易因接觸這些物質(zhì)而受到潛在的危害[5-10]。

關(guān)于食品中環(huán)境激素的檢測方法研究較多,常用的實(shí)驗(yàn)室檢測方法有高效液相色譜-電化學(xué)法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、電化學(xué)傳感器法等[11-38],但關(guān)于空氣,特別是工作場所空氣中環(huán)境激素的檢測方法研究不多。本工作選取使用范圍廣、健康效應(yīng)大的14種環(huán)境激素(雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯雙酚A、17α-雌二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、雙酚A、四溴雙酚A、壬基酚、4-正辛基酚、雙酚F),利用玻璃纖維濾膜富集、超聲洗脫,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定工作場所空氣中上述14種環(huán)境激素的含量,該方法使用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對14種環(huán)境激素進(jìn)行定量檢測,快速、準(zhǔn)確,排除干擾效率較高。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters I-class型超高效液相色譜儀;ABI 5500Trap型離子肼與三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;KQ5200DV型水浴超聲儀;XS205 UD型電子分析天平;Milli-QIntegral Cabinet 5型超純水機(jī);Gilair pl us型空氣采樣器;SF-750型超低容量電動(dòng)噴霧器;37 mm玻璃纖維濾膜,用前需置于500℃馬弗爐中加熱凈化4 h。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg·L-1,分別精密稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至10 mL,充分搖勻,于4℃避光保存。

單標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0 mg·L-1,分別取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置于10 mL容量瓶中,用10%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液稀釋并定容,于4℃避光保存,此溶液至少可保存7 d。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量單標(biāo)準(zhǔn)溶液,用10%甲醇溶液逐級(jí)稀釋,配制成雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯雙酚A的質(zhì)量濃度分別為0.50,1.0,2.0,4.0,5.0,10.0μg·L-1,17α-雌 二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、雙酚A、四溴雙酚A、壬基酚、4-正辛基酚、雙酚F的質(zhì)量濃度分別為5.0,10.0,20.0,40.0,50.0,100.0μg·L-1的 混 合 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯雙酚A、17α-雌二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、雙酚A、四溴雙酚A、壬基酚、4-正辛基酚、雙酚F標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于99.5%;甲醇、乙腈均為色譜純;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters Sy mmetry C18色 譜 柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)及 對 應(yīng) 的C18保 護(hù) 柱(10 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫30℃;進(jìn)樣體積3μL;流量0.2 mL·min-1;流動(dòng)相A為乙腈,B為水。梯度洗脫程序:0～3.0 min時(shí),A為50%;3.0～4.0 min時(shí),A由50%升至70%,保持4.0 min;8.0～8.1 min時(shí),A由70%跳轉(zhuǎn)至90%,保持0.9 min;9.0～9.1 min時(shí),A由90%跳轉(zhuǎn)至50%,保持0.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源,負(fù)離子(ESI-)模式,離子源溫度500℃;氣簾氣壓力240 k Pa,霧化氣壓力345 k Pa,輔助加熱氣壓力345 k Pa,碰撞氣壓力35 k Pa;噴霧電壓4 500 V;采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

短時(shí)間采樣(用于檢測職業(yè)工人短時(shí)間接觸的激素):在采樣點(diǎn),打開裝好玻璃纖維濾膜的采樣夾,以流量5 L·min-1采集空氣樣品15 min,同時(shí)采集空白樣品。

長時(shí)間采樣(用于檢測職業(yè)工人長時(shí)間接觸的激素):在采樣點(diǎn),打開裝好玻璃纖維濾膜的采樣夾,以流量1 L·min-1采集空氣樣品4～8 h,同時(shí)采集空白樣品。

1.3.2 樣品的處理

取采樣后的玻璃纖維濾膜于干凈的具塞玻璃比色管中,加入5 mL體積比為8∶2的甲醇-水混合液,超聲洗脫10 min,洗脫液按儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

為達(dá)到良好的分離效果和靈敏度,試驗(yàn)嘗試了以不同體積比的甲醇-水混合液、乙腈-水混合液為流動(dòng)相體系時(shí)的梯度洗脫程序,最終確定了1.2.1節(jié)所述的梯度洗脫程序。在該流動(dòng)相梯度洗脫程序下14種環(huán)境激素出峰時(shí)間在1.09～5.75 min內(nèi),分離效率較高。在選定的梯度洗脫程序下進(jìn)行質(zhì)譜MRM檢測時(shí),各離子的峰形良好。

圖1為該梯度洗脫程序下14種環(huán)境激素的質(zhì)量色譜圖。

圖1 14種環(huán)境激素的質(zhì)量色譜圖Fig.1 Mass chro matogra ms of 14 environmental hor mones

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用泵以7μL·min-1的速率將0.01～0.1 mg·L-1的單標(biāo)準(zhǔn)溶液導(dǎo)入離子源,找出母離子、子離子,逐步優(yōu)化每個(gè)離子對的去簇電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù),使得選定離子對信號(hào)最強(qiáng)。在找到定量離子、定性離子的質(zhì)譜參數(shù)的基礎(chǔ)上,利用針泵連續(xù)進(jìn)樣的方式對霧化氣壓力、輔助加熱氣壓力和離子源溫度等進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化的質(zhì)譜條件見1.2.2節(jié)。

2.3 空氣富集條件的優(yōu)化

試驗(yàn)采用超低容量噴霧法,將甲醇溶液中的14種環(huán)境激素噴到1 m3的玻璃容器中,分別用活性炭管、硅膠管、玻璃纖維濾膜進(jìn)行樣品采集。結(jié)果表明,活性炭管、硅膠管和玻璃纖維濾膜對14種環(huán)境激素的平均富集效率分別為35.7%～56.2%,44.2%～74.1%和76.2%～91.5%,玻璃纖維濾膜富集效率最高。因此,試驗(yàn)選擇采用玻璃纖維濾膜進(jìn)行富集。

2.4 洗脫溶劑的優(yōu)化

以加標(biāo)玻璃纖維膜為研究對象,試驗(yàn)分別以甲醇、乙腈、體積比為8∶2的甲醇-水混合液、水為洗脫溶劑進(jìn)行測試,考察了洗脫溶劑對14種環(huán)境激素回收率的影響。結(jié)果表明:以水為洗脫溶劑時(shí),14種環(huán)境激素的回收率為45.7%～66.9%;以甲醇、乙腈和體積比為8∶2的甲醇-水混合液為洗脫溶劑時(shí),14種環(huán)境激素的回收率為67.6%～119%,甲醇、乙腈和8∶2的甲醇-水混合液對環(huán)境激素的洗脫效率無明顯區(qū)別。考慮到有機(jī)溶劑用量,試驗(yàn)選擇體積比為8∶2的甲醇-水混合液為洗脫溶劑。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以環(huán)境激素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得14種環(huán)境激素的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算各環(huán)境激素的檢出限(3S/N),以10倍信噪比計(jì)算各環(huán)境激素的測定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of deter mination

結(jié)果表明:14種環(huán)境激素的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與相應(yīng)定量離子峰面積呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.995 1～0.999 9。雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯雙酚A檢出限為0.1μg·L-1,17α-雌二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、雙酚A、四溴雙酚A、壬基酚、4-正辛基酚、雙酚F檢出限為0.5μg·L-1。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

在空白玻璃纖維濾膜中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯雙酚A的質(zhì)量濃度分別為0.75,2.5,4.0μg·L-1,17α-雌二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、雙酚A、四溴雙酚A、壬基酚、4-正辛基酚、雙酚F的質(zhì)量濃度分別為5.0,10.0,50.0μg·L-1的加標(biāo)樣品。每個(gè)濃度水平分別處理6個(gè)樣品,按照試驗(yàn)方法進(jìn)行回收和重復(fù)性試驗(yàn)。每個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品在不同時(shí)間分6次處理和測定,進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表3 (續(xù))

結(jié)果表明:14種環(huán)境激素的回收率為67.6%～119%,重復(fù)性和重現(xiàn)性試驗(yàn)所得RSD分別為1.2%～11%和1.4%～12%。

2.7 樣品分析

對環(huán)境激素類化學(xué)品生產(chǎn)車間的工作場所空氣進(jìn)行長時(shí)間采樣,采集樣品20份,按照試驗(yàn)方法測定,結(jié)果顯示所檢測的14種環(huán)境激素在空氣中的含量均低于檢出限。

本工作將工作場所空氣用玻璃纖維濾膜富集、超聲洗脫后,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定14種環(huán)境激素的含量,操作簡便。該方法不僅靈敏度高、回收率好,而且重復(fù)性和重現(xiàn)性也很好,14種環(huán)境激素可實(shí)現(xiàn)同步分析,適用于工作場所空氣中環(huán)境激素的定性定量檢測、污染情況評(píng)價(jià)。