汪永輝，蕭 閔*，李 瑛，馬 瓏，江曉翠，王 嵐，龔 健，王武勝

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)黃家湖醫(yī)院，湖北 武漢 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心，湖北 武漢 430065；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065）

高尿酸血癥（hyperuricemia, HUA）是內(nèi)源性嘌呤代謝紊亂引起機(jī)體尿酸鹽結(jié)晶析出，沉積于身體各部位，損傷機(jī)體功能的代謝異常綜合征。臨床最常見的表現(xiàn)為尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)，誘發(fā)痛風(fēng)；并且血清長(zhǎng)期高尿酸（uric acid, UA）狀態(tài)也是糖尿病、高血壓、慢性腎病、腦卒中等多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要誘因[1-2]。 UA 排泄異常是HUA 主要發(fā)病機(jī)制，故影響UA 轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白是治療HUA 的靶向分子之一。ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2（ATP-binding cassette transporter G2, ABCG2）是一類跨生物膜運(yùn)輸?shù)牡鞍?，可利用ATP 水解釋放的能量將細(xì)胞內(nèi)UA 產(chǎn)物排出[3-4]。ABCG2 表達(dá)受AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）調(diào)節(jié)，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，通過AMPK/CREB 信號(hào)通路可影響ABCG2 表達(dá)，從而緩解2型糖尿病小鼠的HUA[5]。 因此，調(diào)節(jié)ABCG2/AMPK 通路改善UA 沉積是治療HUA 的有效途徑。

參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》，具有益氣健脾、滲濕止瀉的功效。 臨床運(yùn)用顯示，其能改善HUA 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[6]，治療間歇期痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[7]，調(diào)節(jié)血清白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、C 反應(yīng)蛋白、UA 及紅細(xì)胞沉降率，改善關(guān)節(jié)腫脹及疼痛狀況[8]。目前，尚無相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，并且是否能通過AMPK/ABCG2 改善UA 沉積尚不清楚。 本實(shí)驗(yàn)通過觀察參苓白術(shù)散對(duì)HUA 小鼠模型血清UA 及腸組織AMPK、ABCG2 蛋白的影響，初步探索參苓白術(shù)散降UA 的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性昆明小鼠36 只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0012。 飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0067，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為（22±2） ℃，相對(duì)濕度為50%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利相關(guān)規(guī)定，由湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：HUCMS202111013。

1.2 藥物與試劑

參苓白術(shù)散組成：黨參10 g，茯苓10 g，炒白術(shù)10 g，山藥10 g，炒白扁豆7.5 g，蓮子5 g，炒薏苡仁5 g，砂仁5 g，桔梗5 g，甘草10 g。生藥均購(gòu)自湖北中醫(yī)藥大學(xué)黃家湖醫(yī)院，統(tǒng)一煎煮成生藥含量為1 g/mL 的湯劑。 非布司他片（杭州朱養(yǎng)心藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20210805）。

氧嗪酸鉀（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：YZLCP0016）；羧甲基纖維素鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：CP300-800）；UA（批號(hào)：GM1110）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase, ALT，批號(hào)：GM1102）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase,AST，批號(hào)：GM1103）均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；CysC ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：PC215）、RIPA 裂解液（批號(hào)：P0013B）、超敏電化學(xué)發(fā)光顯影液（批號(hào)：P0018S-2）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GAPDH（批號(hào)：P0018S-2）、兔多抗磷酸化的AMPK（phosphorylated AMPK, p-AMPK）抗體（批號(hào)：bs-3026R）、兔多抗ABCG2 抗體（批號(hào)：bs-0662R）均購(gòu)自北京博奧森生物有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司，批號(hào)：G2026-200T）；總RNA 提取試劑盒（批號(hào)：TSP413）、逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA 試劑盒（批號(hào)：TSK313S）、PCR 試劑盒（批號(hào)：TSE202）均購(gòu)自北京擎科公司。 小鼠AMPK、ABCG2 引物均由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。 詳見表1。

表1 引物序列

1.3 主要儀器

高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號(hào)：KZ-III-F）；冷凍高速離心機(jī)（日本日立公司，型號(hào)：CR21G）；電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠，型號(hào)：DYCZ-40）；RT-qPCR 儀（美國(guó)ABI 公司，型號(hào)：5900）；顯微鏡（型號(hào)：E100）、成像系統(tǒng)（型號(hào)：NikonDS-U3）均購(gòu)自日本尼康公司；全自動(dòng)生化儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號(hào)：Chemray 800）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥方法

36 只小鼠，隨機(jī)分成4 組：空白組、模型組、中藥組、西藥組。空白組除外，其余各組每天腹腔注射氧嗪酸鉀懸液0.6 g/kg，連續(xù)7 d，血清UA 升高提示造模成功[9]。 造模完成后，根據(jù)人給藥劑量，1 劑/d（1 劑生藥為77.5 g），配制1 g/mL 的參苓白術(shù)散懸液。按照小鼠與成人的體表面積換算公式[10]計(jì)算，中藥組給予參苓白術(shù)散5 g/kg 灌胃，西藥組給予非布司他0.25 g/kg 灌胃，空白組、模型組均給予生理鹽水0.1 mL/kg。 各組均干預(yù)14 d。

2.2 取材方法

取材前12 h 禁食不禁水，末次給藥1 h 后，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉，心臟采血，室溫靜置1 h后，3000 r/min、半徑13 cm、4 ℃離心10 min，收集上層血清，置于-80 ℃冰箱內(nèi)冷凍保存。

小鼠安樂死后，快速剝離左葉肝、左側(cè)腎、回腸組織，生理鹽水沖洗干凈，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分組織，經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃低溫冰箱內(nèi)保存。

2.3 生化法檢測(cè)血清UA

取4 μL 血清，加入250 μL 反應(yīng)試劑，波長(zhǎng)510 nm，上機(jī)，全自動(dòng)生化儀自動(dòng)測(cè)定UA。

2.4 ELISA 法檢測(cè)血清CysC 含量

取血清，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒步驟操作，每孔50 μL 血清，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、加樣加酶、溫育、洗滌、顯色、每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CysC 蛋白濃度。

2.5 HE 染色法檢測(cè)腎、回腸組織病理變化

取4%多聚甲醛固定液中固定48 h 的腎、回腸組織，梯度乙醇脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋；5 μm切片、脫蠟，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片。

2.6 Western blot 檢測(cè)回腸組織AMPK、p-AMPK、ABCG2 蛋白表達(dá)

取50 mg 回腸組織，加入1 mL RIPA 裂解液及PMSF 蛋白酶抑制劑，高速組織研磨儀勻漿后置于冰上反應(yīng)30 min，10 000 r/min、半徑13 cm 離心15 min，取上清液蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，制備蛋白樣品。SDS-PAGE 電泳后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，10%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，TBST 洗膜3 次，加入兔多抗ABCG2、p-AMPK 于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜，次日辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，超敏電化學(xué)發(fā)光液顯影。采用Image J 圖像處理軟件計(jì)算出目標(biāo)蛋白和內(nèi)參GADPH 對(duì)應(yīng)條帶灰度值的比值，統(tǒng)計(jì)分析。

2.7 RT-qPCR 檢測(cè)回腸組織ABCG2 mRNA 表達(dá)

取50 mg 回腸組織，加Trizol 1 mL 提取總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。 采用第一鏈互補(bǔ)DNA 合成試劑盒將RNA 轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA，反應(yīng)條件：25 ℃，5 min；52 ℃，15 min；83 ℃，5 min；4 ℃，10 min。 取稀釋5 倍的互補(bǔ)DNA 4 μL，加入上、下游引物各0.2 μL，進(jìn)行RT-qPCR，40 個(gè)循環(huán)。 繪制擴(kuò)增曲線熔解曲線，結(jié)果采用2－△△Ct計(jì)算分析。

2.8 安全性評(píng)估

2.8.1 HE 染色觀察肝病理變化 取4%多聚甲醛固定液中固定48 h 的肝組織，梯度乙醇脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋；5 μm 切片、脫蠟，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片。

2.8.2 生化法檢測(cè)肝功能 取12 μL 血清，加入240 μL 反應(yīng)試劑，波長(zhǎng)340 nm，上機(jī)，全自動(dòng)生化儀自動(dòng)測(cè)定AST；取12 μL 血清，加入240 μL 反應(yīng)試劑，波長(zhǎng)340 nm，上機(jī)，全自動(dòng)生化儀自動(dòng)測(cè)定ALT。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖片分析采用Image Pro Plus 5 軟件分析，數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件分析。 計(jì)數(shù)資料以“±s”表示，數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)及方差齊性檢測(cè)，若兩項(xiàng)皆符合，采用單因素方差（ANOVA）分析；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或者方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。 以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 參苓白術(shù)散對(duì)血清UA、CysC 的影響

與空白組比較，模型組UA、CysC 含量均顯著升高（P＜0.01）。 與模型組比較，西藥組和中藥組UA 含量顯著降低（P＜0.01）；中藥組CysC 含量顯著降低（P＜0.01）。西藥組CysC 含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 中藥組UA、CysC含量與西藥組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖1。

圖1 參苓白術(shù)散對(duì)各組小鼠血清UA、Cysc 水平的影響

3.2 參苓白術(shù)散對(duì)回腸、腎組織病理變化的影響

空白組，腎小球大小均勻，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，邊界明顯，上皮細(xì)胞形態(tài)正常；模型組，腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球未見明顯萎縮，腎小管結(jié)構(gòu)可見，上皮細(xì)胞輕微脫落；中藥組及西藥組上皮細(xì)胞脫落癥狀有所改善。 詳見圖2。

圖2 參苓白術(shù)散對(duì)各組小鼠腎組織的影響（HE 染色）

空白組回腸組織黏膜皺襞規(guī)則，腸絨毛完整、整齊、密集；模型組腸絨毛存在大量炎細(xì)胞團(tuán)，腸絨毛短小，隱窩深度變淺，腸黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度損傷；與模型組比較，中藥組腸絨毛完整，排列較為稀疏，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腸黏膜上皮細(xì)胞損傷有所改善；西藥組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)改善，腸黏膜上皮細(xì)胞損傷，微絨毛壞死脫落，未見明顯好轉(zhuǎn)。 詳見圖3。

圖3 參苓白術(shù)散對(duì)各組小鼠回腸組織的影響（HE 染色）

3.3 參苓白術(shù)散對(duì)回腸組織p-AMPK、ABCG2 蛋白的影響

與空白組比較，模型組p-AMPK、ABCG2 蛋白含量均顯著降低(P＜0.01)。 與模型組比較，中藥組和西藥組p-AMPK、ABCG2 蛋白含量均顯著升高(P＜0.01)。 詳見圖4。

圖4 參苓白術(shù)散對(duì)各組小鼠回腸組織p-AMPK、ABCG2 蛋白的影響

3.4 參苓白術(shù)散對(duì)回腸組織ABCG2 mRNA 的影響

與空白組比較，模型組ABCG2 mRNA 含量顯著降低（P＜0.01)。 與模型組比較，中藥組和西藥組ABCG2 mRNA 均顯著升高（P＜0.01)。 詳見圖5。

圖5 參苓白術(shù)散對(duì)各組小鼠回腸組織ABCG2 mRNA表達(dá)的影響

3.5 參苓白術(shù)散藥物安全性的評(píng)估

3.5.1 對(duì)肝功能的影響 各組間血清ALT、AST 比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖6。

圖6 參苓白術(shù)散對(duì)各組小鼠血清AST、ALT 水平

3.5.2 對(duì)肝組織病理的影響 肝板的細(xì)胞排列緊密，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，從整體來看肝竇無規(guī)律性擴(kuò)張。詳見圖7。

圖7 各組小鼠肝組織病理變化（HE 染色，×40）

4 討論

隨著飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，HUA 發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[11]。 HUA 和痛風(fēng)有明確的因果關(guān)系，是同一種疾病的不同病理過程[12]。 HUA 可引起急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石沉積、痛風(fēng)石性慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)畸形、UA 性腎病等，嚴(yán)重危害患者健康。

早期HUA 無臨床癥狀，通過血清UA 判定其發(fā)病，中醫(yī)學(xué)尚無明確辨證體系。若出現(xiàn)一些列UA 沉積后誘發(fā)癥狀，如關(guān)節(jié)紅腫熱痛等，HUA 則歸屬“痛痹”的范疇。究其病因，為平素多食高粱肥甘厚味，致脾失運(yùn)化而痰濁內(nèi)生；明其病機(jī)，乃為痰阻氣血運(yùn)行，而致氣滯、血瘀；反之，氣滯、血瘀，水津不布又可化生痰濁，正如李東垣《脾胃論·脾胃勝衰論》云：“百病皆由脾胃衰而生”。 《素問·至真要大論》云：“諸濕腫滿，皆屬于脾”，脾虛運(yùn)化無力，則生濕邪，濕邪隨經(jīng)脈、肌肉、三焦等組織泛溢于四肢百骸，從而表現(xiàn)出關(guān)節(jié)腫脹、疼痛等不適。 因此，HUA 中醫(yī)基本病因病機(jī)可概括為“肥甘厚味，脾失運(yùn)化，諸濕腫滿”。

參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》，具有益氣健脾的功效，由薏苡仁、甘草、桔梗、砂仁、白術(shù)、白茯苓、黨參、山藥組成。 方中黨參、白術(shù)、茯苓、甘草，為四君子湯，益氣健脾；加上山藥、炒白扁豆，補(bǔ)土生金，兼有補(bǔ)肺的作用；薏苡仁祛濕，砂仁暖胃，蓮子補(bǔ)心，陳皮燥濕，桔梗辛開宣肺，載藥上行。該方益氣健脾，針對(duì)痛痹的主要病機(jī)，具有一定療效[13]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，薏苡仁具有抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎藥理作用，能舒經(jīng)除痹，改善關(guān)節(jié)疼痛[14]；茯苓提取出茯苓多糖及三萜類成分，具有利尿、保肝、鎮(zhèn)靜、提高免疫力、抗炎、抗腫瘤以及降血脂等多種藥理作用[15]，茯苓可通過緩解腎臟損傷及調(diào)節(jié)腸道菌群來促進(jìn)機(jī)體內(nèi)UA 的排泄進(jìn)而達(dá)到降UA 的效果[16]。 因此，提示參苓白術(shù)散具有改善痛風(fēng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

UA 是碳、氮、氫和氧的雜環(huán)化合物，是存在于血液循環(huán)中的嘌呤代謝的氧化產(chǎn)物，體內(nèi)的UA 水平通過其生成和排泄的平衡來維持，生成、排泄失衡是HUA 發(fā)生的根本原因[17]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散降低模型小鼠血清UA 沉積，證明參苓白術(shù)散具有調(diào)節(jié)UA 過量沉積的功能，具有防止HUA 的作用。UA 在生理pH 值下以尿酸鹽陰離子的形式存在，不能透過細(xì)胞膜，需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCG2 是一種在近端腎小管上排泄尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其活性決定了細(xì)胞內(nèi)UA 水平，ABCG2 也在肝和腸細(xì)胞中表達(dá)。 已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠腸道ABCG2 的功能障礙或活性喪失會(huì)增加尿中UA 的排泄[18]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散升高模型小鼠回腸組織ABCG2 表達(dá)，降低血清UA。 ABCG2 是利用ATP 水解釋放的能量完成UA 轉(zhuǎn)運(yùn)，AMPK 是促進(jìn)產(chǎn)生ATP 的分解代謝重要途徑[19]。AMPK 激活依賴于蘇氨酸172α 環(huán)位點(diǎn)的磷酸化，當(dāng)AMPKA 磷酸化完成，才能發(fā)揮其正常功能[20]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散影響AMPK的磷酸化，調(diào)節(jié)ABCG2 蛋白表達(dá)。

綜上所述，參苓白術(shù)散調(diào)節(jié)HUA 小鼠腸組織AMPKA 磷酸化，升高ABCG2 表達(dá)，降低血清UA 含量是治療HUA 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。并且本實(shí)驗(yàn)通過血清肝功能、肝組織病理評(píng)估參苓白術(shù)散藥物安全性，結(jié)果顯示參苓白術(shù)散對(duì)肝功能及肝組織無影響，值得臨床推廣應(yīng)用。 本研究不足之處，未能檢測(cè)AMPK通路其他相關(guān)蛋白，進(jìn)一步明確參苓白術(shù)散防治HUA的機(jī)制。