唐 圓，黃莉莉，譚周進(jìn)，謝果珍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

七味白術(shù)散為中國傳統(tǒng)方劑，由炒白術(shù)、人參、木香、茯苓、藿香、葛根、甘草組成，有健脾益氣、解肌止渴的功效，治療脾虛泄瀉效果甚佳[1]。中藥成分復(fù)雜，具有多途徑、多靶點治療的優(yōu)勢[2]，七味白術(shù)散中有苷、多糖、揮發(fā)油、生物堿等成分[3]。苷類化合物是七味白術(shù)散中一類重要的藥理活性成分，如人參皂苷，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡的作用，研究發(fā)現(xiàn)人參可以有效緩解與慢性腸道衰竭相關(guān)的胃腸道疾病，可減輕患者腹脹、腹瀉等癥狀[4-6]，葛根素具有降脂、抗炎、胰島素抵抗等活性，研究證明，葛根素具有止瀉功能，能增加胃殘留率，降低腹瀉指數(shù)[7]，甘草素具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗癌以及增強(qiáng)記憶力等生物活性，是小兒瀉寧糖漿中主要的活性成分，具有止瀉作用[8-10]。因此，七味白術(shù)散中苷類成分可能是其治療腹瀉的主要成分。

苷類成分極性大，可溶于水，因此常用水提法，提取時間、提取次數(shù)、提取溫度和料液比等均影響其得率[11]。Box-Behnken 響應(yīng)面分析法表示不能用線性關(guān)系描述的函數(shù)，是一種經(jīng)濟(jì)有效的實驗設(shè)計方法，廣泛應(yīng)用于生物工程、化學(xué)工業(yè)、分析化學(xué)、食品工藝等領(lǐng)域[12]。筆者將提取工藝與Box-Behnken 響應(yīng)面分析法相結(jié)合，設(shè)計3 因素3 水平分析試驗，旨在確立七味白術(shù)散總苷最佳的提取工藝，為七味白術(shù)散總苷的后續(xù)研究提供質(zhì)量穩(wěn)定的樣品。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

UV1901PCS 紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、循環(huán)水式真空泵（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）。

七味白術(shù)散處方藥材購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，詳細(xì)來源見表1。

表1 七味白術(shù)散處方藥材來源

1.2 試驗方法

1.2.1 七味白術(shù)散粗總苷的提取按比例稱取七味白術(shù)散各味藥粉碎后過60 目篩的粉末，置于燒杯中，加入14 倍體積的蒸餾水，煎煮2 次，53 min/次，合并水煎液濃縮至一定體積，加入無水乙醇，使乙醇終濃度為75%，攪拌均勻后4℃靜置過夜。將乙醇提取液濃縮至20 mL，再依次用石油醚脫脂3 次（10、5 和5 mL），乙酸乙酯萃取3 次（15、10 和10 mL），合并乙酸乙酯層至蒸發(fā)皿中蒸干至恒重，水層繼續(xù)用水飽和正丁醇萃取3 次（15、10 和10 mL）。合并正丁醇層至蒸發(fā)皿中蒸干至恒重，正丁醇部位和乙酸乙酯部位作為七味白術(shù)散總苷。

1.2.2 七味白術(shù)散粗總苷含量測定方法用課題組優(yōu)化DNS 法測七味白術(shù)散總苷含量。

七味白術(shù)散總苷含量=水解后總糖含量-水解前總糖含量

七味白術(shù)散總苷提取率（%）=（水解后總糖含量-水解前總糖含量）×m2/M=[（ρ2-ρ1）×V1×V2×N/m1]×m2/M

式中：ρ1為七味白術(shù)散粗總苷中還原糖濃度（μg/mL），ρ2為七味白術(shù)散總苷水解后總糖濃度（μg/mL），V1為水解液定容后的體積（mL），V2為七味白術(shù)散總苷溶液體積（mL），N 為稀釋倍數(shù)，m1為水解稱量七味白術(shù)散總苷的質(zhì)量（g），m2為提取七味白術(shù)散總苷的質(zhì)量（g），M 為七味白術(shù)散粉末的質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計對煎煮時間、料液比、提取次數(shù)逐一進(jìn)行考察，每個因素5 個水平進(jìn)行分析，得到最佳提取條件。煎煮時間的水平設(shè)定為15、30、45、60 和75 min；料液比的水平設(shè)定為1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12 和1 ∶14（g/mL）；提取次數(shù)的水平設(shè)定為1、2、3、4 和5 次。

1.2.4 響應(yīng)面試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上用Design Expert 10 軟件中的Box Behenken 設(shè)計原理，以七味白術(shù)散總苷的提取率為響應(yīng)值，以煎煮時間（A）、提取次數(shù)（B）、料液比（C）為變量因素，設(shè)計3 因素3 水平的響應(yīng)面分析試驗（見表2），優(yōu)化七味白術(shù)散總苷的提取工藝。

表2 提取工藝響應(yīng)面設(shè)計因素水平

1.2.5 數(shù)據(jù)處理用GraphPad Prism 5 軟件作圖，用Design Expert 10 軟件對單因素實驗數(shù)據(jù)和響應(yīng)面設(shè)計試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，繪制各單因素試驗變化趨勢圖、建立線性回歸方程、判斷試驗設(shè)計模型顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 煎煮時間對七味白術(shù)散總苷提取率的影響由圖1 可知，煎煮時間對提取率影響較大，煎煮時間范圍在15～60 min 提取率隨著煎煮時間的延長而增加，當(dāng)煎煮時間增加到60 min，提取率達(dá)到峰值后不再增加，反而呈現(xiàn)下降趨勢。其原因可能是煎煮60 min 苷類成分充分溶出，而繼續(xù)煎煮則部分苷類物質(zhì)發(fā)生降解。苷類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有苷鍵，苷鍵容易發(fā)生斷裂，如氧苷類化合物易降解形成半縮醛結(jié)構(gòu)[13]，因此，選擇最佳煎煮時間為60 min。

圖1 煎煮時間對七味白術(shù)散總苷提取率的影響

2.1.2 提取次數(shù)對七味白術(shù)散總苷提取率的影響如圖2 所示，提取2 次時七味白術(shù)散總苷提取率最高，超過2 次后提取率降低，其可能原因是提取次數(shù)越多，七味白術(shù)散中其他化合物如多糖、生物堿等溶出也越多，過濾后水提液的量越多，濃縮后其他物質(zhì)可能會影響苷類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而影響對苷類化合物的檢測。因此選擇提取2 次為最佳提取次數(shù)。

圖2 提取次數(shù)對七味白術(shù)散提取率的影響

2.1.3 料液比對七味白術(shù)散總苷提取率的影響如圖3 所示，當(dāng)料液比在1 ∶6 至1 ∶12（g/mL）范圍內(nèi)，七味白術(shù)散總苷提取率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)料液比調(diào)整至1 ∶12（g/mL）時，提取率增加到最大值，然后隨著料液比的增加提取率下降。其原因可能是料液比在1 ∶12 時，苷類化合物的溶出基本完成，繼續(xù)增加溶液，使七味白術(shù)散中其他物質(zhì)的溶出增加，從而抑制了苷類化合物的溶出，因此選擇最佳料液比為1 ∶12（g/mL）。

圖3 料液比對七味白術(shù)散總苷提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 模型建立與顯著性分析Box-Behnken 響應(yīng)面分析法試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

2.2.2 方差分析使用Design Expert 10 軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到多元二次響應(yīng)面回歸方程為Y（%）=8.553+0.113A+1.242B+0.719C-3.469AB-2.893AC-0.014BC-5.948A2-0.194B2-0.020C2，方差分析見表3。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面分析法試驗設(shè)計與結(jié)果

由表4 可知，七味白術(shù)散總苷提取率的模型達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），表明該模型對分析七味白術(shù)散總苷提取率具有合理性。相關(guān)系數(shù)R2= 0.934 8，該模型能解釋93.48%響應(yīng)值的變化，校正系數(shù)R2Adj=0.851 0 ＞0.8，變異系數(shù)c.v. %= 14.01，顯示該模型的可信度較好，可以用來分析七味白術(shù)散提取率，根據(jù)表4 中F 值，推測影響七味白術(shù)散提取率的因素為提取次數(shù)（B）＞料液比（C）＞煎煮時間（A）。從表4中得知，二次項AC、C2對響應(yīng)值具有顯著影響（P＜0.05），A2、B2對響應(yīng)值有極顯著影響（P＜0.01）。

表4 試驗結(jié)果的方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析等高線形狀反映各因素交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素之間的交互作用顯著，橢圓的中心點即是響應(yīng)面的最高點，也是模型得到的最佳條件[14]。由圖4 可知，響應(yīng)面的坡度順著提取次數(shù)最大，結(jié)合方差分析結(jié)果，提取次數(shù)的交互作用對七味白術(shù)散總苷提取率的影響最顯著，料液比次之，煎煮時間的影響不顯著。

圖4 各因素交互作用對七味白術(shù)散總苷提取率的影響

使用Design Expert 10 軟件分析可知，七味白術(shù)散總苷最大提取率為0.67%，此時最佳提取條件是煎煮時間52.90 min、提取次數(shù)1.87 次，料液比1 ∶13.69（g/mL），考慮到實際操作的條件，將提取條件修改為煎煮時間53 min、提取次數(shù)2 次、料液比1 ∶13.7（g/mL）。

2.3 驗證試驗

根據(jù)Design Expert 10 軟件優(yōu)化的提取工藝，對優(yōu)化工藝進(jìn)行3 次驗證，結(jié)果七味白術(shù)散總苷的提取率分別為0.71%、0.70%、0.72%，提取率的平均值為（0.71 ± 0.01）%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.02%，實際值與預(yù)測值接近，說明該提取工藝穩(wěn)定。綜上所述，該優(yōu)化工藝方案具有可靠性，可用于實際應(yīng)用。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面優(yōu)化了七味白術(shù)散的總苷提取工藝，結(jié)果表明：七味白術(shù)散總苷的最佳提取工藝為煎煮時間53 min、提取次數(shù)2 次、料液比1 ∶13.7（g/mL），在此工藝下，七味白術(shù)散總苷的平均提取率提升至（0.71±0.01）%。