曾志成，李銀鑫，秦惠鈺，蔣鵬飛，彭 俊*，彭清華*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南桂陽縣第一人民醫(yī)院，湖南 郴州 424400；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

青光眼是一組以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells, RGCs）進(jìn)行性凋亡及視神經(jīng)纖維的丟失為特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。 目前，對(duì)于青光眼的治療以降低眼壓為主，但即使控制眼壓仍不能完全阻止青光眼患者視神經(jīng)的持續(xù)性損傷和退行性改變[2]。 本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，青光安Ⅱ號(hào)方對(duì)眼壓已控制的青光眼患者的視神經(jīng)能起到一定的保護(hù)作用[3]，并通過高通量篩選體系多模式（水提醇提-溶劑分配分離-大孔樹脂） 提取分離手段得到了青光安Ⅱ號(hào)方的有效組分[4]。 為明確青光安Ⅱ號(hào)方有效組分對(duì)青光眼視神經(jīng)的保護(hù)作用及機(jī)制，本研究將青光安Ⅱ號(hào)方有效組分配制成低、中、高3 種梯度劑量作用于青光眼模型DBA/2J 小鼠，以驗(yàn)證其是否具有抑制RGCs 凋亡、保護(hù)視神經(jīng)的作用，同時(shí)對(duì)其保護(hù)視神經(jīng)的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只10 周齡SPF 級(jí)DBA/2J 小鼠，雌性，體質(zhì)量18～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，質(zhì)量合格證號(hào)：No.1100111911055898；20 只10 周齡SPF 級(jí)野生型C57BL/6J 小鼠，雌性，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，質(zhì)量合格證號(hào)：1107271911002463。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（湘）：2019-0009，飼養(yǎng)過程維持相同實(shí)驗(yàn)條件，光/暗周期為12 h/12 h（光照時(shí)間6:00～18:00），背景噪聲為（40±10） db，溫度（23±3） ℃，動(dòng)物飼料為標(biāo)準(zhǔn)化顆粒飼料，動(dòng)物自由進(jìn)食、進(jìn)水。 動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作遵循美國(guó)視覺和眼科研究學(xué)會(huì)（Association for Reearch in Vision and Ophthalmology, ARVO）和湖南中醫(yī)藥大學(xué)制定的科研動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)室使用規(guī)范。實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LL2019100802）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 青光安Ⅱ號(hào)湯劑由枸杞子、黃芪、女貞子等道地藥材按規(guī)定比例用滅菌蒸餾水制成懸混液；基于團(tuán)隊(duì)前期中藥高通量篩選體系[5-6]對(duì)青光安Ⅱ號(hào)方中藥組分庫的篩選，提取出青光安Ⅱ號(hào)方有效組分懸混液。 益脈康分散片：湖南湘雅制藥有限公司，規(guī)格：400 mg/片，批號(hào)：1903119。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 蘇木素染液（批號(hào)：G1004）、伊紅染液（批號(hào)：G1001）、Proteinase K（批號(hào)：G1234）、檸檬酸抗原修復(fù)液（批號(hào)：G1202）、麗春紅染液（批號(hào)：G2011）、HRP 標(biāo)記-山羊抗兔二抗（批號(hào)：GB23301）、BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：G2026），均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；兔抗糖原合酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）多克隆抗體（批號(hào)：bs-0023M）、兔抗β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）多克隆抗體（批號(hào)：bs-1165R）、兔抗同源盒基因-6（Paired box gene-6, Pax6）多克隆抗體（批號(hào)：bs-11204R）、兔抗β-Actin 多克隆抗體（批號(hào)：bs-0016R），均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 Tono-pen AVIA 型筆式眼壓計(jì)（美國(guó)Reichert 公司）；SL-2G 型裂隙燈顯微鏡（日本Topcon 公司）；Micron Ⅳ型小動(dòng)物視網(wǎng)膜影像系統(tǒng)（美國(guó)Phoenix Research Labs 公司）；SK3300H 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；RM2235 型石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；RT-2100C 型酶標(biāo)檢測(cè)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；Neofuge 13R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；MX-F 型渦旋混合器、TSY-B 型脫色搖床（武漢賽維爾生物科技有限公司）；DYCZ-24DN 型雙垂直電泳儀、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；alphaEaseFC 灰度分析軟件（美國(guó)Alpha Innotech 公司）；Adobe PhotoShop 圖像分析軟件 （美國(guó)Adobe公司）。

1.2 方法

1.2.1 眼壓測(cè)量 所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后開始測(cè)量眼壓，在小鼠清醒狀態(tài)下由兩人配合使用Tonopen AVIA 接觸式眼壓筆每4 周測(cè)量1 次，測(cè)量時(shí)間為早上9:00 至12:00。 取連續(xù)10 次測(cè)量的平均值（且LCD 上顯示置信指標(biāo)≥95）作為該眼眼壓值。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 DBA/2J 小鼠從28 周齡開始眼壓逐漸升高，28～44 周齡持續(xù)高眼壓，56 周齡眼壓開始降低[7]，本實(shí)驗(yàn)將38 周齡的DBA/2J 小鼠初步納入慢性高眼壓青光眼模型組，由于DBA/2J小鼠高眼壓在個(gè)體中存在一定差異，在同年齡段不同小鼠、同小鼠不同眼別眼壓升高進(jìn)程不平衡[8]，根據(jù)DBA/2J 小鼠38 周齡時(shí)平均眼壓和標(biāo)準(zhǔn)差，剔除眼壓值平均值在±3 mmHg 范圍以外的DBA/2J小鼠。

第38 周齡時(shí)，從C57BL/6J 小鼠中隨機(jī)選取8只（30 眼）納入組成正常對(duì)照組（A 組）；在剔除后剩余的DBA/2J 小鼠中選取48 只（180 眼），按照隨機(jī)數(shù)字表法平均分為青光眼模型組（B 組）、益脈康分散片組（C 組）、青光安Ⅱ號(hào)方湯劑組（D 組）、青光安Ⅱ號(hào)方有效組分低劑量組（E 組）、青光安Ⅱ號(hào)方有效組分中劑量組（F 組）、青光安Ⅱ號(hào)方有效組分高劑量組（G 組）。藥物均用蒸餾水作為溶劑進(jìn)行配制，各組小鼠給藥藥物配制濃度、給藥劑量見表1。

表1 各組小鼠給藥藥物配制濃度及給藥劑量

1.2.3 取材方法 灌胃4 周后，各組小鼠行頸椎脫臼處死，仔細(xì)剝離小鼠眼球，一只置于裝有2.5 mL FAS 眼球固定液的EP 管中，固定25 min 后，取出眼球，沿角鞏膜緣剪開，除去角膜、虹膜、晶狀體，制作成含視網(wǎng)膜的眼杯，放入FAS 眼球固定液中繼續(xù)固定48 h，石蠟包埋切片，備行HE 染色、TUNEL 染色、免疫組化染色。 另一只眼球置于冰盤上，用眼科顯微器械沿角鞏膜緣剪開，除去角膜、虹膜、晶狀體，迅速剝離出視網(wǎng)膜組織，置入EP 管中，再放入液氮罐中保存，備行Western blot 檢測(cè)。

1.2.4 視網(wǎng)膜石蠟切片標(biāo)本制作 采用80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅲ分別脫水10～15 min；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明10～15 min；56 ℃石蠟浸蠟1 h。浸蠟后的眼杯水平切面朝向包埋盒底，58～60 ℃硬蠟包埋，蠟塊冷卻后，室溫保存待切；用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，靠近視乳頭的位置開始切片，厚約4 μm，每個(gè)眼杯至少切取3 張切片包含有視網(wǎng)膜，40～46 ℃水浴，放在水上展平切片；把切片置于載物片的三分之一處，撈于載物片中央，晾干，放在切片盒內(nèi)，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.5 視網(wǎng)膜HE 染色 取出各組小鼠視網(wǎng)膜組織切片，每張視網(wǎng)膜選取一張切片，400 倍鏡下拍照。

1.2.6 視網(wǎng)膜RGCs 凋亡檢測(cè) 取出各組小鼠視網(wǎng)膜石蠟切片，每張視網(wǎng)膜選取一張切片，根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。 細(xì)胞核固縮、胞漿濃縮，細(xì)胞核呈棕褐色為陽性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取1 個(gè)視野（×400）拍照，計(jì)數(shù)視野中陽性著色RGCs 數(shù)目，計(jì)算出RGCs 細(xì)胞的凋亡指數(shù)（凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/RGCs 總細(xì)胞數(shù)×100%），取平均值。

1.2.7 視網(wǎng)膜GSK-3β、β-Catenin 及Pax6 蛋白表達(dá)半定量檢測(cè) 取出各組小鼠視網(wǎng)膜石蠟切片，每張視網(wǎng)膜選取3 張切片，每張切片用于檢測(cè)1 個(gè)蛋白，根據(jù)通用二步法試劑盒中說明書操作步驟進(jìn)行。胞漿、細(xì)胞核及細(xì)胞膜之一出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取1 個(gè)視野（×400）拍照。 重點(diǎn)觀察每張切片上神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞染色情況。

1.2.8 視網(wǎng)膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達(dá)定量檢測(cè) 取出各組小鼠視網(wǎng)膜組織，每組每2 張視網(wǎng)膜組織為1 個(gè)樣本，共檢測(cè)4 個(gè)樣本。 步驟如下：（1）將每個(gè)視網(wǎng)膜組織勻漿、裂解，后轉(zhuǎn)移至離心管中，移至臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min（半徑95 mm），離心后取上清并轉(zhuǎn)移至1.5 mL 新的離心管中，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?（2）蛋白濃度測(cè)定：用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度。（3）制備Western blot 實(shí)驗(yàn)用蛋白樣品。（4）SDSPAGE 電泳。（5）轉(zhuǎn)膜。（6）染色、封閉。（7）孵育一抗：先用封閉液稀釋各指標(biāo)一抗（兔抗-GSK3β、兔抗-β/Catenin、兔抗-Pax6 及兔抗β-Actin 多克隆抗體，均按照1∶1000 稀釋），然后棄去封閉袋中的封閉液，加入稀釋的一抗，置于4 ℃冰箱中孵育過夜。 （8）孵育二抗。 （9）將條帶放在保鮮膜上，設(shè)定曝光時(shí)間進(jìn)行曝光、拍照。采用AlphaEaseFC 軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析各目標(biāo)蛋白的灰度值，以β-Actin 蛋白灰度值作為內(nèi)參，二者比值即為灰度值，表示蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6J 小鼠與DBA/2J 小鼠眼壓

20 只（40 眼）C57BL/6J 小鼠在10～38 周齡眼壓一直波動(dòng)在10～16 mmHg。 100 只（200 眼）DBA/2J小鼠在10 周齡和34 周齡測(cè)量眼壓時(shí)，分別有1 只小鼠死亡，死亡小鼠當(dāng)周雙眼眼壓數(shù)據(jù)即開始不納入統(tǒng)計(jì)范圍內(nèi)。DBA/2J 小鼠眼壓在10～22 周齡之間逐漸上升。 詳見圖1。

圖1 C57BL/6J 小鼠和DBA/2J 小鼠10～38 周齡不同時(shí)相點(diǎn)眼壓

2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)

A 組小鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰、完整、染色均勻，清晰可見3 個(gè)核層，由內(nèi)向外依次為GCL、內(nèi)核層（inner nuclear layer, INL）以及外核層（outer nuclear layer, ONL）；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈單層排列，比較連續(xù)無間斷，細(xì)胞大小不一，呈圓形或橢圓形，INL 及ONL細(xì)胞呈多層分布，內(nèi)叢狀層（inner plexiform layer, IPL）位于GCL 與INL 之間，外叢狀層（outer plexiform layer,OPL）位于INL 與ONL 之間。 B 組以GCL 損傷最為明顯，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯減少，連續(xù)性中斷，胞內(nèi)空泡樣變性，核固縮。 C 組、D 組、E 組、F 組、G 組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目增多，胞內(nèi)空泡樣變性改變均有所改善，以C 組、D 組、F 組、G 組較為明顯。 詳見圖2。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)（HE，×400）

2.3 各組小鼠視網(wǎng)膜RGCs 凋亡情況

A 組小鼠視網(wǎng)膜呈現(xiàn)核固縮的細(xì)胞較少；B 組在GCL、INL 及ONL 層均可見大量核固縮細(xì)胞，TUNEL 染色呈現(xiàn)棕褐色且為深染，視網(wǎng)膜厚度明顯變??；C 組、D 組、F 組、G 組核固縮和TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)目減少，且為淺染。 詳見圖3。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層RGCs 凋亡情況（Tunel，×400）

與A 組比較，B 組凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組、D 組、E 組、F 組、G 組凋亡指數(shù)均明顯降低（P＜0.01）；與C 組或D 組比較，E 組凋亡指數(shù)升高（P＜0.05 或P＜0.01），G 組凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。 詳見圖4。

圖4 各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層凋亡指數(shù)比較

2.4 各組小鼠視網(wǎng)膜GSK-3β、β-Catenin 及Pax6免疫組化染色情況

GSK-3β、β-Catenin 和Pax6 蛋白在小鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，在內(nèi)核層也可以見到其少許表達(dá)，在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，其表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。 與A 組比較，B 組視網(wǎng)膜GSK-3β表達(dá)量明顯升高（P<0.01），β-Catenin 和Pax6 表達(dá)量明顯降低（P<0.01）；與B 組比較，C 組、D 組、E組、F組、G 組GSK-3β 表達(dá)量均明顯降低（P<0.01），C 組、D 組、F 組、G 組β-Catenin 表達(dá)量均有升高（P<0.05或P<0.01），C 組、D 組、F 組、G 組Pax6 表達(dá)量均有升高（P<0.05 或P<0.01）；與C 組和D 組比較，G 組GSK-3β 表達(dá)量降低（P<0.05），β-Catenin 和Pax6 表達(dá)量升高（P<0.01）。 詳見圖5 至圖7、表2。

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達(dá)量比較（±s，n=4）

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達(dá)量比較（±s，n=4）

注：與A 組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與B 組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01；與C 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與D 組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 組G 組F 值P 值GSK-3β 0.30±0.06 0.85±0.07◆◆0.62±0.09◆◆●●0.60±0.05◆◆●●0.58±0.06◆◆●●0.46±0.11◆◆●●0.42±0.03◆●●▲★★24.280 0.000 β-Catenin 0.78±0.13 0.20±0.08◆◆0.28±0.07◆◆●0.31±0.08◆◆●0.32±0.06◆◆0.35±0.07◆◆●●0.41±0.04◆◆●●▲▲★★22.204 0.000 Pax6 0.83±0.13 0.25±0.05◆◆0.36±0.07◆◆●●0.37±0.04◆◆●0.39±0.08◆◆0.42±0.10◆◆●●0.49±0.05◆◆●●▲▲★★21.330 0.000

圖5 各組視網(wǎng)膜GSK-3β 蛋白表達(dá)（免疫組化，×400）

圖7 各組視網(wǎng)膜pax6 蛋白表達(dá)（免疫組化，×400）

2.5 各組視網(wǎng)膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達(dá)量

圖6 各組視網(wǎng)膜β-Catenin 蛋白表達(dá)（免疫組化，×400）

與A 組比較，B 組視網(wǎng)膜GSK-3β 表達(dá)量明顯升高（P<0.01），β-Catenin 和Pax6 表達(dá)量明顯降低（P<0.01）；與B 組比較，C 組、D 組、E 組、F 組、G 組GSK-3β 表達(dá)量均明顯降低（P<0.01），C 組、D 組、G 組β-Catenin 表達(dá)量均有升高（P<0.05 或P<0.01），C組、D 組、F 組、G 組Pax6 表達(dá)量均有升高（P<0.05或P<0.01）；與C 組和D 組比較，G 組GSK-3β 表達(dá)量降低（P<0.05），β-Catenin 和Pax6 表達(dá)量升高（P<0.01）。 詳見圖8、表3。

圖8 各組視網(wǎng)膜GSK-3β、β-catenin 及Pax6 蛋白電泳圖

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達(dá)量比較（±s，n=4）

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜GSK-3β、β-Catenin、Pax6 蛋白表達(dá)量比較（±s，n=4）

注：與A 組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與B 組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01；與C 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與D 組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 組G 組F 值P 值GSK-3β 0.25±0.04 0.70±0.10◆◆0.50±0.08◆◆●●0.52±0.07◆◆●●0.54±0.09◆◆●●0.49±0.08◆◆●●0.38±0.05◆●●▲★14.099 0.000 β-Catenin 0.73±0.07 0.15±0.04◆◆0.25±0.03◆◆●0.26±0.05◆◆●0.20±0.04◆◆0.22±0.03◆◆0.48±0.09◆◆●●▲▲★★54.220 0.000 Pax6 0.64±0.10 0.16±0.04◆◆0.30±0.06◆◆●●0.28±0.06◆◆●0.24±0.05◆◆0.33±0.07◆◆●●0.48±0.08◆◆●●▲▲★★21.205 0.000

3 討論

DBA/2J 小鼠是一種年齡相關(guān)性高眼壓青光眼視神經(jīng)損傷模型，在一定時(shí)期內(nèi)隨著年齡的增長(zhǎng)眼壓逐漸升高，升高的眼壓導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡和軸突變性。 它是由于GPNMB 和TYRP1 基因突變[9]導(dǎo)致虹膜脫色素、虹膜萎縮，脫落的色素和細(xì)胞碎片聚集在房水外流通道中，導(dǎo)致房水外流受阻，引起高眼壓，繼而產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、視盤神經(jīng)纖維層變薄以及視盤變大等視神經(jīng)損害。 SHELDON 等[10]于1995 年首次對(duì)其進(jìn)行了描述，該青光眼模型具有自然性、年齡相關(guān)性及進(jìn)展性，類似人類青光眼發(fā)病方式，所以在青光眼實(shí)驗(yàn)研究中得以廣泛使用，特別是在探討壓力相關(guān)性視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、視神經(jīng)變性機(jī)制[11-12]和評(píng)估視神經(jīng)保護(hù)藥物療效[13]等方面。 DBA/2J 小鼠的眼壓增高程度具有一定的個(gè)體化差異，本研究發(fā)現(xiàn)，DBA/2J 小鼠38 周齡時(shí)，98 只（196 眼）眼壓波動(dòng)范圍在16～37（23.47±2.44） mmHg，進(jìn)行離群值取舍后判定眼壓波動(dòng)范圍在16.15～30.79 mmHg 之間，故將眼壓<16.15 mmHg和>30.79 mmHg 的DBA/2J 小鼠予以剔除。

Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路主要由Wnt 家族分子等組成的配體[14]，包括卷曲蛋白（frizzlled, FZ）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related protein 5/6, LRP-5/6）等跨膜受體，GSK-3β、結(jié)腸腺瘤樣息肉病基因產(chǎn)物（adenomatous polyposis coli, APC）、蓬亂蛋白（dishevelled, Dsh）、β-Catenin、軸蛋白（Axin）等調(diào)節(jié)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF 家族等組成。 當(dāng)存在分泌的Wnt 蛋白時(shí)，細(xì)胞外Wnt 蛋白與細(xì)胞膜上的FZ/LRP 受體結(jié)合啟動(dòng)Wnt/β-Catenin 信號(hào)，然后通過磷酸化并激活細(xì)胞漿內(nèi)的Dsh 蛋白，抑制GSK-3β/APC/Axin 復(fù)合物對(duì)β-Catenin 的磷酸化，胞漿內(nèi)β-Catenin 累積并穩(wěn)定后會(huì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與TCF/LEF 家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)下游Pax6、Ngn2、c-myc、cylinD1 等靶基因的表達(dá)，這些基因多是參與細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控的基因[5]。 在沒有Wnt 蛋白存在或者GSK-3β 活化過度時(shí)，GSK-3β/APC/Axin 復(fù)合物在GSK-3β 的作用下將降解β-Catenin，而不能引起下游相關(guān)靶基因的表達(dá)，使Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路處于抑制或關(guān)閉狀態(tài)，因此，GSK-3β 是許多神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[15]。

青光眼作為一種眼部神經(jīng)退行性疾病，病理機(jī)制與其他神經(jīng)退行性疾病相似，存在神經(jīng)元Tau 蛋白磷酸化異常、軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)障礙、凋亡及變性等病理改變[16-18]。 在慢性高眼壓病程中伴隨有GSK-3β 活化的危險(xiǎn)因素，比如視網(wǎng)膜的缺血缺氧、DNA 損傷、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、β 淀粉樣蛋白異常沉積等[19-21]。 研究也證實(shí)，慢性高眼壓可引起視網(wǎng)膜視神經(jīng)GSK-3β活化與過度表達(dá)[22]，使視網(wǎng)膜視神經(jīng)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)，包括Pax6 在內(nèi)的下游靶基因表達(dá)將可能受到抑制，而Pax6 靶基因可以通過上調(diào)Math5 和Brn3b 蛋白水平，可以促使胚胎干細(xì)胞分化形成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞[23]，參與細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控。 通過抑制GSK-3β 過度活化，促使β-Catenin表達(dá)與向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，可以促進(jìn)Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路激活，從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，延緩神經(jīng)退行性疾病病程進(jìn)展的目的[24-26]。

青光眼的疾病特征就是進(jìn)行性RGCs 死亡和神經(jīng)纖維喪失，凋亡是RGCs 死亡的主要途徑[1]。SCHUETTAUF 等[27]用TUNEL 法標(biāo)記凋亡的RGCs，發(fā)現(xiàn)DBA/2J 小鼠RGCs 凋亡峰時(shí)出現(xiàn)在6 月齡。 而楊帆等[28]用Nissl 染色標(biāo)記法追蹤DBA/2J 小鼠RGCs丟失情況，發(fā)現(xiàn)RGCs 丟失從7 月齡開始，高峰時(shí)在9～11 月齡，14 月齡RGCs 僅零星可見。 觀察到的DBA/2J 小鼠RGCs 凋亡高峰時(shí)間不同可能是由于他們采取了不同的研究方法所致。 本研究選取38 周齡的DBA/2J 小鼠作為青光眼視神經(jīng)損傷模型，通過TUNEL 法標(biāo)記凋亡的RGCs，發(fā)現(xiàn)38 周齡DBA/2J小鼠凋亡指數(shù)達(dá)到55.86%±8.53%，明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01）。 進(jìn)一步說明了DBA/2J 小鼠自38周齡后具有顯著的RGCs 凋亡特征，是理想的青光眼視神經(jīng)損傷模型，對(duì)于評(píng)估視神經(jīng)保護(hù)藥物的療效是可行的。 采用益脈康分散片、青光安Ⅱ號(hào)方、青光安Ⅱ號(hào)方有效組分低、中、高劑量干預(yù)青光眼模型DBA/2J 小鼠4 周，發(fā)現(xiàn)益脈康分散片、青光安Ⅱ號(hào)方湯劑、青光安Ⅱ號(hào)方有效組分低中、高劑量均能夠明顯延緩或阻止DBA/2J 小鼠RGCs 的凋亡；其中青光安Ⅱ號(hào)方有效組分高劑量對(duì)DBA/2J 小鼠RGCs的凋亡抑制作用明顯優(yōu)于益脈康分散片和青光安Ⅱ號(hào)方湯劑。

GSK-3β 和β-Catenin 是Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路中的兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)蛋白分子[29]，GSK-3β 活化過度時(shí)，GSK-3β/APC/Axin 復(fù)合物在GSK-3β 的作用下將降解β-Catenin，不能引起下游Pax6 等靶基因的表達(dá)。 通過Western blot 檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜GSK-3β、β-Catenin 及Pax6 蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組C57BL/6J 小鼠比較，青光眼模型組GSK-3β 在視網(wǎng)膜表達(dá)水平明顯升高，β-Catenin 和Pax6在視網(wǎng)膜表達(dá)水平明顯降低（P<0.01），說明38 周齡后DBA/2J 小鼠視網(wǎng)膜Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)，下游Pax6 基因同樣難以表達(dá)。 益脈康分散片、青光安Ⅱ號(hào)方、青光安Ⅱ號(hào)方有效組分個(gè)劑量組干預(yù)青光眼模型組DBA/2J 小鼠4 周后，發(fā)現(xiàn)益脈康分散片、青光安Ⅱ號(hào)方湯劑、青光安Ⅱ號(hào)方有效組分高劑量均能激活DBA/2J 小鼠視網(wǎng)膜Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白及下游Pax6 基因表達(dá)，且青光安Ⅱ號(hào)方有效組分高劑量組的作用更為明顯。

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了青光安Ⅱ號(hào)方有效組分高劑量具有明顯抑制青光眼動(dòng)物模型RGCs 細(xì)胞凋亡、保護(hù)視神經(jīng)的作用，其作用與激活Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路和下游Pax6 基因表達(dá)關(guān)系密切。 在后期研究中，本團(tuán)隊(duì)將采用UPLC-Q-TOF 法，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和化合物質(zhì)譜信息，分析鑒定出該有效組分的相關(guān)化學(xué)成分，為治療青光眼的中藥新藥的研發(fā)提供基礎(chǔ)。