李映慧,謝俊霞,王俊,

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)腦科學(xué)與疾病研究院)

帕金森病(PD)是一種進(jìn)展緩慢的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制迄今尚不明確，許多研究表明慢性炎癥參與了PD的發(fā)病[1-2]。脂多糖(LPS)作為一種炎癥源，已被證明是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元死亡的有效引發(fā)劑[3]。C57BL/6小鼠黑質(zhì)、紋狀體、側(cè)腦室內(nèi)注射LPS均可以誘導(dǎo)黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)陽性的多巴胺能神經(jīng)元脫失、運(yùn)動(dòng)行為改變和紋狀體多巴胺減少[4]。有研究表明，黑質(zhì)中鐵的異常沉積在PD的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[5-6]。過量的鐵可以通過Fenton反應(yīng)促進(jìn)羥自由基的生成，造成細(xì)胞損傷。LPS在小鼠模型中引發(fā)的神經(jīng)元損傷，與腦鐵積累和一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)通過黑質(zhì)注射LPS及鐵螯合劑去鐵胺(DFO)，采用免疫組織化學(xué)方法檢測黑質(zhì)中TH陽性多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量，探討DFO對(duì)LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠單籠飼養(yǎng)于有適量食物和水的潔凈動(dòng)物房內(nèi)，可以自由飲食。動(dòng)物房室溫(20±2)℃，濕度(50±2)%，12/12 h晝夜循環(huán)光照。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物使用和管理經(jīng)青島大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑：LPS、DFO購于美國Sigma公司，TH兔抗多克隆抗體購于英國Abcam公司，其余試劑均從當(dāng)?shù)卦噭┕举徺I。

1.2 動(dòng)物分組與處理

將40只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、DFO組和LPS+DFO組，每組10只。小鼠用異戊烷麻醉后固定在腦立體定位儀上，調(diào)整耳桿使小鼠頭部位于同一平面。碘附消毒后剪開小鼠顱腦背側(cè)皮膚，用體積分?jǐn)?shù)0.03的過氧化氫溶液擦拭顱骨表面至顱縫和前后囟清晰可見。黑質(zhì)定位坐標(biāo)：前囟后3.1 mm，左右旁開1.5 mm，深度4.1 mm。通過顯微注射針以0.2 μL/min的流量注射完畢后留針10 min。對(duì)照組注射生理鹽水1 μL，LPS組注射1 mg/L的LPS 1 μL，DFO組注射50 mmol/L的DFO 1 μL，DFO+LPS組注射1 mg/L LPS和50 mmol/L DFO的混合液1 μL，繼續(xù)喂養(yǎng)7 d進(jìn)行后續(xù)檢測[8]。

1.3 TH陽性神經(jīng)元檢測

采用免疫組織化學(xué)法檢測TH陽性神經(jīng)元的數(shù)量。小鼠灌注取腦，制備20 μm厚切片，每只小鼠留腦片4張。腦片以40 g/L多聚甲醛溶液固定10 min，應(yīng)用0.01 mol/L PBS溶液洗3次(每次10 min)，山羊血清封閉2 h，加TH一抗孵育過夜；用0.01 mol/L PBS 溶液洗3次(每次10 min)，加二抗孵育；以0.01 mol/L PBS溶液洗3次(每次10 min)，DAB顯色，中性樹膠封片。在20倍物鏡下計(jì)數(shù)每張腦片黑質(zhì)區(qū)陽性神經(jīng)元，將每張腦片中的陽性神經(jīng)元總數(shù)再乘以 4，即得到黑質(zhì)區(qū) TH陽性神經(jīng)元總數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

對(duì)照組、DFO組、LPS組和LPS+DFO組黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元總數(shù)分別為(14.75±1.75)×103、(12.14±2.32)×103、(5.26±1.42)×103和(11.14±1.18)×103(n=6)。析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，DFO和LPS兩種因素存在交互作用(F=36.40，P<0.05)。主效應(yīng)分析顯示，LPS組與對(duì)照組相比，TH陽性神經(jīng)元總數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.58，P<0.05)；DFO組與對(duì)照組相比，TH陽性神經(jīng)元總數(shù)降低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.58，P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，DFO組與對(duì)照組相比，TH陽性神經(jīng)元總數(shù)差異無顯著性(F=4.84，P=0.05)；LPS組與對(duì)照組相比較，TH陽性神經(jīng)元總數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=106.15，P<0.05)；LPS+DFO組與LPS組相比較，TH陽性神經(jīng)元總數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.74，P<0.05)；而LPS+DFO組與DFO組相比，TH陽性神經(jīng)元總數(shù)差異無顯著性(F=0.88，P=0.37)。

3 討 論

PD作為僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性喪失和紋狀體多巴胺耗竭[8]，與小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙密切相關(guān)[9-10]。大量研究結(jié)果表明，神經(jīng)炎癥在PD的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用，源自非神經(jīng)元細(xì)胞(包括小膠質(zhì)細(xì)胞)的炎癥遞質(zhì)，如活性氧(ROS)、一氧化氮、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)均可以調(diào)節(jié)PD中神經(jīng)元細(xì)胞死亡的進(jìn)程[11-13]。紋狀體內(nèi)注射LPS可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致羥自由基的產(chǎn)生及細(xì)胞外多巴胺、谷氨酸和腺苷水平上升，并引發(fā)多巴胺能神經(jīng)元損傷反應(yīng)[14]。

鐵作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長及發(fā)育所必需的微量元素，在正常衰老和神經(jīng)退行性疾病的許多生物過程中起著重要作用，不僅參與調(diào)節(jié)線粒體產(chǎn)生能量，還與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常髓鞘形成密切相關(guān)[15]。大量研究顯示，PD病人存在鐵代謝異常，病人腦中鐵逐漸積累，特別是在黑質(zhì)致密部[16-17]。鐵介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷與其參與ROS的生成有關(guān)，過氧化氫在多巴胺氧化脫氨基過程中產(chǎn)生，它與Fe2+反應(yīng)，產(chǎn)生羥基自由基，破壞蛋白質(zhì)、核酸和膜磷脂等，進(jìn)而引起多巴胺能神經(jīng)元損傷[18]。

鐵螯合劑作為PD的潛在治療藥物，通過降低不穩(wěn)定的鐵的水平來預(yù)防和治療模型小鼠PD[15]。DFO可以螯合過多的三價(jià)鐵，清除過量游離鐵，抑制羥自由基生成，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。有研究證實(shí)，DFO預(yù)處理可以改善LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活和降低海馬中升高的IL-1β和TNF-α水平，阻止LPS誘導(dǎo)的海馬中丙二醛和超氧化物歧化酶水平的增加，并降低其誘導(dǎo)的鐵積累[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，神經(jīng)炎癥會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，通過白細(xì)胞介素6信號(hào)，刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放鐵調(diào)素，向神經(jīng)元發(fā)送信號(hào)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)元鐵的沉積，進(jìn)而引起神經(jīng)元損傷[19-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LPS組相比，DFO聯(lián)合LPS處理組黑質(zhì)TH陽性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，這可能與DFO螯合鐵從而降低ROS水平有關(guān)。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鐵螯合劑DFO具有防止LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元死亡的神經(jīng)保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，我們將繼續(xù)探索其相關(guān)機(jī)制，為對(duì)抗神經(jīng)炎癥的生物學(xué)效應(yīng)開辟一條新的途徑，也為PD的治療提供新的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。