黨曉婷,郇雪潔,焦倩,姜宏

(青島大學(xué)國(guó)家生理學(xué)重點(diǎn)(培育)學(xué)科,山東 青島 266071)

膠質(zhì)瘤是一種極為常見(jiàn)的原發(fā)性惡性顱內(nèi)腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的81%[1]。目前膠質(zhì)瘤的治療方法包括手術(shù)、化療和放療等，但病人的中位生存期較短，預(yù)后差[2]。因此，研究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)新的療法有重要意義。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)最重要的體系，它通過(guò)在底物的泛素化和去泛素化之間建立動(dòng)態(tài)平衡參與廣泛的細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、凋亡、表觀遺傳和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[3-6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，泛素化酶和去泛素化酶參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并可能成為潛在的抗癌靶點(diǎn)。泛素特異性蛋白酶USP39通過(guò)誘導(dǎo)mRNA成熟，增加含有WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子1(TAZ)的蛋白水平促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展進(jìn)程[7-8]；而敲除去泛素化酶USP8可間接靶向 RNA結(jié)合蛋白SF2/ASF1，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，從而應(yīng)對(duì)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)[9]。OTUD3屬于卵巢腫瘤蛋白酶(OTU)家族，也是一種去泛素化酶[10]。已有研究表明，OTUD3可能在細(xì)胞環(huán)境中參與促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生[11-12]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明，與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的OTUD3蛋白表達(dá)顯著降低[13]。為了研究OTUD3對(duì)星形膠質(zhì)瘤發(fā)生的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)OTUD3，探究過(guò)表達(dá)OUTD3對(duì)C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞為大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(以色列BI公司)，胎牛血清(FBS，北京全式金生物公司)，青鏈霉素合劑、Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(北京索萊寶公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS和體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素合劑的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化3 min，加入少量完全培養(yǎng)液終止消化，收集至50 mL離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液后加入新鮮培養(yǎng)液，用吸管輕吹充分懸浮細(xì)胞，移至新的培養(yǎng)瓶中傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，24 h后，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為Myc-Vector組和Myc-OTUD3組，分別轉(zhuǎn)染Myc-Vector質(zhì)粒載體和Myc-OTUD3質(zhì)粒載體。向Myc-Vector組的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入Myc-Vector質(zhì)粒，Myc-OTUD3組基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入Myc-OTUD3質(zhì)粒，靜置5 min后與配制好的LipofectaminTM2000混合液混合，室溫靜置10～20 min。向6孔板中每孔加入1 200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)液及300 μL質(zhì)?；旌弦海糜诤w積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)4～8 h后換新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.2.3Western Blot檢測(cè)OTUD3蛋白表達(dá) 將轉(zhuǎn)染后的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞6孔板取出，棄上清液，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液冰上裂解，提取細(xì)胞蛋白。每孔上樣蛋白量為20 μg，以90 V恒定電壓電泳，300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜1 h，100 g/L脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。加一抗4 ℃過(guò)夜孵育，以TBST溶液清洗3次，每次10 min；加二抗室溫孵育1 h，以TBST溶液漂洗。配制ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影。

1.2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染48 h的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液按每孔100 μL接種于5個(gè)96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)目為(3～4)×103個(gè)。每日同一時(shí)間點(diǎn)向96孔板中加入CCK-8溶液10 μL，置培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度，連續(xù)記錄5 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 用胰酶消化細(xì)胞后，將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液接種于6孔板中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2周后棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS溶液緩慢沖洗，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，觀察結(jié)晶紫染色情況，統(tǒng)計(jì)著色的細(xì)胞集落數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Myc-OTUD3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)OTUD3蛋白表達(dá)水平的變化

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Myc-Vector組(0.403±0.065)相比較，Myc-OTUD3組(0.832±0.105)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中OTUD3蛋白表達(dá)水平明顯升高(n=6，t=3.472，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2 過(guò)表達(dá)OTUD3對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染Myc-OTUD3質(zhì)粒后，連續(xù)5 d檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染和時(shí)間存在交互效應(yīng)(F=12.300，P<0.001)。進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析結(jié)果顯示，與Myc-Vector組相比，Myc-OTUD3組在轉(zhuǎn)染4、5 d時(shí)的細(xì)胞增殖水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6，F(xiàn)=17.326、70.345，P<0.001)，表明細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制。見(jiàn)圖2。

圖1 Western Blot檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)OTUD3蛋白表達(dá)的變化

與Myc-Vector組相比，***F=17.326、70.345，P<0.001。

2.3 過(guò)表達(dá)OTUD3對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫染色的結(jié)果顯示，與Myc-Vector組(103.300±5.239)相比較，Myc-OTUD3組(77.670±4.702)的細(xì)胞克隆數(shù)顯著降低(n=3，t=3.646，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)OTUD3對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最具侵襲性的惡性腦腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的膠質(zhì)瘤組織學(xué)類型，約占膠質(zhì)瘤的45%[14-15]。雖然基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)已進(jìn)行多年，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤仍是成年人最致命的原發(fā)性惡性腦腫瘤之一[16-17]。目前膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)化治療是在可行的范圍內(nèi)進(jìn)行手術(shù)切除，然后進(jìn)行單獨(dú)放療或化療與替莫唑胺藥物聯(lián)合治療，但預(yù)后較差[18-19]。由于腫瘤組織學(xué)相同的病人預(yù)后不同，因此研究膠質(zhì)瘤中不同的分子表達(dá)變化可能是開(kāi)發(fā)新的有效治療方法和提高病人生存率的有效途徑。

人類基因組中總共編碼90種去泛素化酶[20]，OTU作為去泛素化酶的一個(gè)亞型，通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)、炎癥和腫瘤生長(zhǎng)等，在多種生物調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[21-24]。含有OTU結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(OTUD)是OTU的一個(gè)亞家族，OTUD3是OTU家族中的一種重要酶，由398個(gè)氨基酸組成[25]。近期的研究顯示，OTUD3在癌癥中發(fā)揮重要的作用，其表達(dá)下調(diào)與乳癌病人的不良預(yù)后相關(guān)，OTUD3作為一種腫瘤抑制因子通過(guò)直接去泛素化并穩(wěn)定P53，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[26-27]。有研究表明，OTUD3作為腫瘤突變抑制因子人第10號(hào)染色體缺失并與張力蛋白同源的磷酸酶(PTEN，即MMAC1)的去泛素化酶，在乳癌OTUD3-PTEN軸中發(fā)揮去泛素化功能并穩(wěn)定PTEN，在腫瘤抑制過(guò)程中起到重要作用[11,28]。泛素特異性肽酶USP13能夠促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[29]。此外，在肝細(xì)胞癌中OTUD3能夠通過(guò)去泛素化增強(qiáng)α-輔肌動(dòng)蛋白4(ACTN4)的穩(wěn)定性，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[30]。盡管多項(xiàng)研究結(jié)果已經(jīng)證明OTUD3參與癌癥的進(jìn)程[31-35]，但目前關(guān)于OTUD3在膠質(zhì)瘤特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮的細(xì)胞功能卻少有研究。

本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究結(jié)果已經(jīng)證明，與正常腦組織相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中OTUD3的轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)，而C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中OTUD3的mRNA以及蛋白表達(dá)水平明顯低于正常原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，且OTUD3高表達(dá)的膠質(zhì)瘤病人比低表達(dá)的膠質(zhì)瘤病人存活時(shí)間更長(zhǎng)[13]。本次研究通過(guò)CCK-8和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果表明，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)OTUD3可以降低C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖水平，進(jìn)一步說(shuō)明了OTUD3對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生的作用，為靶向治療膠質(zhì)瘤提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。