康新玥，魏敏，江森，王歡，郭學(xué)武,2，肖冬光,2，武曉樂(lè),2，陳葉福,2*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津，300457)

GB/T 13662—2018《黃酒》中定義黃酒是以稻米、黍米、小米、玉米、小麥、水等為主要原料，經(jīng)加曲和/或部分酶制劑、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒。黃酒酒度較低，酒體醇香，富含蛋白質(zhì)、氨基酸等多種有益人體健康的物質(zhì)，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。近年來(lái)，隨著消費(fèi)水平的提高，消費(fèi)者不僅關(guān)注風(fēng)味口感，還越來(lái)越關(guān)注健康，而黃酒中的高級(jí)醇含量在發(fā)酵酒中較高，是限制黃酒行業(yè)發(fā)展的制約性因素之一[2]。黃酒中的高級(jí)醇主要包括異戊醇、異丁醇、正丙醇、苯乙醇等。適量的高級(jí)醇賦予黃酒以醇厚感，但是高級(jí)醇含量過(guò)高不僅影響其風(fēng)味口感，而且會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不適感甚至毒害作用，使飲用者飲后易醉、易暈眩且不利人體健康，其含量過(guò)低也會(huì)導(dǎo)致黃酒風(fēng)味寡淡，酒體不豐盈[3-6]。因此，調(diào)控黃酒中的高級(jí)醇含量對(duì)于黃酒行業(yè)的發(fā)展意義重大。

目前研究表明，黃酒等發(fā)酵酒中的高級(jí)醇主要由釀酒酵母代謝產(chǎn)生，其生成途徑主要是氨基酸分解代謝途徑和糖代謝途徑。在釀酒酵母中降低脫羧酶(PDC酶系)、醇脫氫酶(ADH酶系)的活性同時(shí)提高醛脫氫酶(ADL酶系)的活性，可以達(dá)到降低高級(jí)醇生成量的目的。乙醛脫氫酶屬于釀酒酵母丙酮酸脫氫酶旁路(pyruvate dehydrogenase bypass，PDB)中的酶，氧化乙醛生成乙酸[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明過(guò)表達(dá)乙醛脫氫酶基因ALD6可降低52.8%的高級(jí)醇，但ALD6基因的過(guò)表達(dá)也提高了酵母的乙酸生成量(為出發(fā)菌株的3.6倍)，這在一定程度上影響了酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能，且乙酸含量過(guò)高會(huì)對(duì)酒體協(xié)調(diào)性產(chǎn)生不利影響[8]。

常用的啟動(dòng)子主要有組成型和誘導(dǎo)型2種，組成型啟動(dòng)子大多為強(qiáng)啟動(dòng)子，某些基因不需要過(guò)強(qiáng)的表達(dá)量，否則會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物毒性或代謝負(fù)擔(dān)，對(duì)生長(zhǎng)代謝有負(fù)面影響[9]。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子則是在特定培養(yǎng)條件下才有誘導(dǎo)基因表達(dá)的能力，可以通過(guò)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)條件來(lái)掌控基因表達(dá)的水平，Phxts是受葡萄糖濃度誘導(dǎo)的HXT系列啟動(dòng)子，對(duì)不同濃度葡萄糖的響應(yīng)程度及親和力存在差異[10]，可達(dá)到根據(jù)不同糖濃度動(dòng)態(tài)調(diào)控ALD6基因表達(dá)的目的。黃酒發(fā)酵是雙邊發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中的糖濃度是動(dòng)態(tài)變化的，因此，本研究采用動(dòng)態(tài)調(diào)控策略[11-12]，選用6種HXT系列的糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Phxt1、Phxt2、Phxt3、Phxt4、Phxt5、Phxt7)過(guò)表達(dá)ALD6基因構(gòu)建重組菌株，在具有降低高級(jí)醇效果的同時(shí)，降低其對(duì)酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)生的不利影響，為生產(chǎn)舒適健康的黃酒提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract-peptone-dextrose，YEPD)培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10、蛋白胨20、葡萄糖20，115 ℃，滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉5、蛋白胨10、NaCl 10，121 ℃，滅菌20 min。

半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L)：半乳糖10，蛋白胨20，酵母浸粉10，121 ℃，滅菌20 min。

一級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L)：將玉米糖化清液糖度調(diào)至8° Bx，酵母浸粉5。

二級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L)：將玉米糖化清液糖度調(diào)至12° Bx，酵母浸粉5。

1.2 儀器與設(shè)備

22331Harmburg型PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Eppendorf公司；PowerPacTM型電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Bioscreen全自動(dòng)凝膠成像儀，上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司；7890A型氣相色譜、1100型高效液相色譜，安捷倫科技；StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR，美國(guó)AB公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組菌株的構(gòu)建

根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)報(bào)道的釀酒酵母的基因序列使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，用于構(gòu)建重組菌株及驗(yàn)證。通過(guò)查閱文獻(xiàn)及在NCBI上確定誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的序列用于構(gòu)建不同啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)ALD6基因的重組菌株。引物序列見(jiàn)表2。

表2 PCR引物Table 2 PCR primers

續(xù)表2

本實(shí)驗(yàn)在前期改造菌株a-Ppgk1-ALD6的基礎(chǔ)上更換誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Phxt3為例說(shuō)明用啟動(dòng)子Phxt3過(guò)表達(dá)ALD6基因構(gòu)建重組菌株a-Phxt3-A的過(guò)程，實(shí)驗(yàn)均以a-Ppgk1-ALD6(該菌株在BAT2位點(diǎn)過(guò)表達(dá)ALD6基因，其中啟動(dòng)子為Ppgk1，終止子為Tcps1)基因組為模板，分別使用引物對(duì)B3-U/D、A3-U/D和P3-U/D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得上同源臂BA、ALD6-Tcps1-BB和啟動(dòng)子Phxt3片段；以質(zhì)粒PUG6為模板，使用引物K3-U/D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到KanMX片段。通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將BA，ALD6-Tcps1-BB，Phxt3，KanMX片段全部導(dǎo)入酵母細(xì)胞，酵母自身通過(guò)胞內(nèi)DNA assembly實(shí)現(xiàn)多片段的組裝，并由同源臂介導(dǎo)的同源重組將目的基因表達(dá)整合到過(guò)表達(dá)位點(diǎn)[13]，同源重組過(guò)程如圖1所示。

圖1 Phxts啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)ALD6釀酒酵母菌株同源重組過(guò)程Fig.1 Homologous recombination process of overexpression ALD6 with Phxts promoter in Saccharomyces cerevisiae

在含有300 μg/mL G418抗性的YEPD培養(yǎng)基上篩選重組菌株。以提取重組菌株的基因組DNA為模板，以菌株a-Ppgk1-ALD6基因組為陰性對(duì)照，用驗(yàn)證引物YZ-BAT2-U/D、YC-U/YA-D、H3-U/D對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。其余菌株驗(yàn)證引物前2對(duì)均與舉例引物相同，第3對(duì)引物為對(duì)應(yīng)序號(hào)標(biāo)記驗(yàn)證引物。

通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pGAPza質(zhì)粒導(dǎo)入重組菌株，挑取轉(zhuǎn)化子于半乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，稀釋涂布于YEPD培養(yǎng)基。將長(zhǎng)出的單菌落在YEPD培養(yǎng)基和含300 μg/mL G418抗性的YEPD培養(yǎng)基進(jìn)行點(diǎn)板，挑出在G418抗性培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)而在YEPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，提取其基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證。若以該基因組為模板PCR擴(kuò)增KanMX片段，不能得到1 600 bp左右的條帶，而以轉(zhuǎn)化前重組菌株的基因組為模板能擴(kuò)增得到該基因片段，即說(shuō)明菌株成功去除KanMX篩選標(biāo)記。

1.3.2 過(guò)表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定

將酵母接種于5 mL YEPD液體試管，180 r/min、30 ℃培養(yǎng)12 h，然后取500 μL轉(zhuǎn)接于5 mL YEPD液體試管，相同條件培養(yǎng)4 h后，采用由TaKaRa公司提供的試劑盒Yeast Processing Reagent (for total RNA preparation) Code No.9089，按操作說(shuō)明書收集菌體、提取總RNA；然后進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄、去除DNA；最后采用儀器Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System，以UBC6基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，測(cè)定待測(cè)菌株的mRNA水平。本實(shí)驗(yàn)RNA的逆轉(zhuǎn)錄、去除DNA以及Real Time PCR實(shí)驗(yàn)所用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)由TaKaRa公司提供[14]。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

首先用接種環(huán)在斜面刮取一環(huán)酵母菌株于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基試管中，180 r/min，30 ℃，培養(yǎng)12 h。振蕩混勻菌液后，分別取10、20、30和40 μL菌液轉(zhuǎn)入含有1 mL液體YEPD的EP管中。然后取300 μL加入100孔深孔板，取300 μL YEPD液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)24 h，之后每隔0.5 h測(cè)其在600 nm處的吸光度值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，OD600為縱軸，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵種子液培養(yǎng)：取酵母菌接種到裝有5 mL一級(jí)種子培養(yǎng)基的試管，30 ℃靜置24 h，然后將其全部接入含有45 mL二級(jí)種子培養(yǎng)基的150 mL三角瓶，30 ℃靜置20 h。

大米清液制備：

大米→蒸煮→液化→糖化→過(guò)濾滅菌→接菌發(fā)酵

操作要點(diǎn)：大米蒸煮后加3 000 mL蒸餾水、耐高溫α-淀粉酶500 μL、麥曲150 g，70 ℃水浴90 min。糖化酶500 μL，60 ℃水浴8 h，過(guò)濾得大米糖化清液。每瓶142 mL分裝至250 mL三角瓶。按種子培養(yǎng)的方法培養(yǎng)酵母種子液，然后接種7.5 mL菌液于上述瓶中密封發(fā)酵。

傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵工藝流程[4]：

大米→蒸煮→攤晾→拌曲→接菌→補(bǔ)水發(fā)酵

操作要點(diǎn)：大米和水按質(zhì)量比1∶1蒸煮0.5 h。攤晾冷卻1 h。大曲的用量為大米的15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，拌勻裝入500 mL三角瓶。接菌700萬(wàn)個(gè)/g，米和水按質(zhì)量比1∶1補(bǔ)加水，混勻密封，30 ℃發(fā)酵7 d。

1.3.5 檢測(cè)方法

按照GB/T 13662—2018《黃酒》中斐林試劑法測(cè)定還原糖，酒精計(jì)比重法[15]測(cè)定酒精度，根據(jù)稱重確定CO2排放量。

采用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中乙酸含量[7]：Aminex HPX-87H色譜柱，柱溫60 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。

采用氣相色譜法測(cè)定餾出液高級(jí)醇的生成量[16]：氣相色譜儀Agilent 7890C，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測(cè)器溫度200 ℃。進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1。載氣為高純度N2，流速2.0 mL/min。起始柱溫50 ℃，保持8 min，再以5 ℃/min的升溫速度升溫至120 ℃，保持5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)ALD6基因釀酒酵母的構(gòu)建

2.1.1ALD6基因過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建與驗(yàn)證

利用6種HXT系列糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Phxt1、Phxt2、Phxt3、Phxt4、Phxt5和Phxt7構(gòu)建過(guò)表達(dá)ALD6的重組菌株a-Phxt1-A，a-Phxt2-A，a-Phxt3-A，a-Phxt4-A，a-Phxt5-A和a-Phxt7-A，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。以a-Phxt3-A菌株的構(gòu)建為例，構(gòu)建過(guò)程如1.3.1所述，對(duì)重組菌株a-Phxt3-A的驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示。用引物YZ-BAT2-U/D、YC-U/YA-D、H3-U/D對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證，上游驗(yàn)證引物YZ-BAT2-U/D，得到2 694 bp的條帶；中游驗(yàn)證引物H3-U/D，得到3 430 bp的條帶；下游驗(yàn)證引物YC-U/YA-D，得到1 691 bp的條帶，對(duì)照均無(wú)條帶。由圖2可知，PCR驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)期一致，說(shuō)明菌株構(gòu)建成功。之后通過(guò)1.3.1的方法去除重組菌株KanMX抗性標(biāo)記。

圖2 重組菌株a-Phxt3-A的PCR定點(diǎn)驗(yàn)證Fig.2 PCR verification of the recombinant strain a-Phxt3-A注：M：DL5 000 bp Marker；泳道1、3和5分別為重組菌株a-Phxt3-A的上、中和下游驗(yàn)證，泳道2、4和6為其陰性對(duì)照

2.1.2 基因表達(dá)水平的測(cè)定

按照1.3.2對(duì)ALD6基因表達(dá)量進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 出發(fā)菌株和重組菌株的ALD6基因表達(dá)量結(jié)果Fig.3 Result of ALD6 expression level in the original and recombinant strains

其中a-Ppgk1-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt1-A、a-Phxt7-A、a-Phxt2-A和a-Phxt5-A中ALD6基因表達(dá)量分別是出發(fā)菌株的6.37、3.85、1.81、1.45、1.3、1.25、1.22和1.05倍，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Phxt3對(duì)ALD6基因的表達(dá)產(chǎn)生的效果僅次于組成型強(qiáng)啟動(dòng)子Ppgk1。本實(shí)驗(yàn)使用普通YEPD培養(yǎng)基作為培養(yǎng)條件(葡萄糖濃度在20 g/L左右)，若改變培養(yǎng)基條件，糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控ALD6基因表達(dá)的強(qiáng)度可能也會(huì)改變。因此圖3中的ALD6基因的相對(duì)表達(dá)量?jī)H能證明誘導(dǎo)型啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)ALD6基因重組菌株構(gòu)建成功。

2.2 出發(fā)菌株和重組菌株的生長(zhǎng)性能

2.2.1 YEPD培養(yǎng)基條件下的生長(zhǎng)曲線

按照材料與方法1.3.3測(cè)定各菌株在YEPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖4所示，相較于出發(fā)菌，過(guò)表達(dá)ALD6的重組菌株生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率和穩(wěn)定期時(shí)的生物量均略低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ALD6基因可能影響酵母生長(zhǎng)。而采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)ALD6菌株的生長(zhǎng)性能比a-Ppgk1-A稍好，這表明誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的強(qiáng)度弱于組成型啟動(dòng)子Ppgk1，其調(diào)控ALD6表達(dá)對(duì)酵母的生長(zhǎng)性能影響相對(duì)較小。此條件下的生長(zhǎng)曲線可說(shuō)明糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Phxts在YEPD培養(yǎng)基的條件下表達(dá)強(qiáng)度弱于組成型啟動(dòng)子Ppgk1，由于Phxts啟動(dòng)子對(duì)葡萄糖濃度的響應(yīng)強(qiáng)度不同，此培養(yǎng)條件與黃酒發(fā)酵條件下的糖濃度有很大差別，故后續(xù)采用大米清液體系測(cè)定各菌株生長(zhǎng)性能。

圖4 出發(fā)菌株和重組菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of the original and recombinant strains

2.2.2 大米清液體系中的生長(zhǎng)性能

傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵屬于半固態(tài)發(fā)酵，無(wú)法直接測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中各菌株的生長(zhǎng)性能，為測(cè)定在黃酒發(fā)酵條件中各菌株的生長(zhǎng)性能，按1.3.4大米清液體系模擬傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵體系，調(diào)節(jié)初始葡萄糖濃度70 g/L左右，發(fā)酵時(shí)每隔2 h取樣檢測(cè)600 nm處吸光度，以O(shè)D600值來(lái)衡量菌株在大米清液體系中的生長(zhǎng)性能。由圖5可知，過(guò)表達(dá)ALD6基因的重組菌株在0～12 h的生長(zhǎng)速率均低于出發(fā)菌株，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ALD6基因影響酵母生長(zhǎng)。最終重組菌株a-Ppgk1-A生物量顯著低于其余菌株，a-Phxt1-A略低于出發(fā)菌，但重組菌株a-Phxt2-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt5-A和a-Phxt7-A最終生物量與出發(fā)菌株沒(méi)有顯著差異，再次驗(yàn)證了在大米清液體系中，采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Phxt2、Phxt3、Phxt4、Phxt5、Phxt7)調(diào)控ALD6基因的過(guò)表達(dá)可相對(duì)減弱其對(duì)酵母生長(zhǎng)性能的影響。

圖5 出發(fā)菌株和重組菌株在大米清液體系中的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of the original and recombinant strains in supernatant of rice wine fermentation

2.3 出發(fā)菌株和重組菌株的發(fā)酵性能

將出發(fā)菌株a17和重組菌株a17-△B、a-Ppgk1-A、a-Phxt1-A，a-Phxt2-A，a-Phxt3-A，a-Phxt4-A，a-Phxt5-A和a-Phxt7-A按照1.3.4的方法進(jìn)行傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定各菌株的CO2排放量、酒精度和發(fā)酵液中還原糖剩余量。如表3所示，采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Phxts過(guò)表達(dá)ALD6基因的菌株還原糖余量相較于出發(fā)菌稍高，但低于重組菌株a-Ppgk1-A，且對(duì)酒精生成量和CO2排放量幾乎沒(méi)有影響。而重組菌株a-Ppgk1-A還原糖余量最高，CO2排放量和酒精度均低于出發(fā)菌和其他重組菌株，說(shuō)明組成型啟動(dòng)子Ppgk1過(guò)表達(dá)ALD6基因?qū)臧l(fā)酵性能影響最大，與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果一致。綜上所述，過(guò)表達(dá)ALD6基因?qū)湍赴l(fā)酵性能會(huì)產(chǎn)生影響，但采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)ALD6基因可相對(duì)改善這一現(xiàn)象。

表3 出發(fā)菌株和重組菌株基本發(fā)酵性能的比較Table 3 Fermentation performances of the original and recombinant strains

2.4 出發(fā)菌株和重組菌株的乙酸和高級(jí)醇生成量

2.4.1 出發(fā)菌株和重組菌株的乙酸生成量

乙醛脫氫酶氧化乙醛產(chǎn)生乙酸，本研究檢測(cè)了傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵條件下所得發(fā)酵液中乙酸的生成量(圖6)。重組菌株a-Phxt5-A、a-Phxt2-A、a-Phxt7-A、a-Phxt1-A、a-Phxt4-A、a-Phxt3-A和a-Ppgk1-A的乙酸生成量分別是出發(fā)菌株a17的1.24、1.29、1.4、2、2.88、3和4.44倍。其中重組菌株a-Ppgk1-A的乙酸生成量最高，達(dá)到1.11 g/L，表明在傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵體系中，組成型強(qiáng)啟動(dòng)子Ppgk1調(diào)控ALD6基因表達(dá)的強(qiáng)度要高于糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Phxts，在糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中，重組菌株a-Phxt3-A乙酸生成量最高，達(dá)到0.75 g/L。從乙酸的生成量可大致說(shuō)明在此傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵體系中糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控ALD6基因表達(dá)的強(qiáng)度為Phxt3>Phxt4>Phxt1>Phxt7>Phxt2>Phxt5，與2.1.2以YEPD培養(yǎng)基為培養(yǎng)條件時(shí)，基因表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果基本一致，調(diào)控ALD6基因表達(dá)水平越高，則乙酸生成量也越高。

圖6 出發(fā)菌株和重組菌株的乙酸生成量Fig.6 Acetic acid production of the original and recombinant strains

綜上，當(dāng)乙酸含量較高時(shí)，對(duì)酵母生長(zhǎng)性能產(chǎn)生不利影響，通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控ALD6基因的表達(dá)，可相應(yīng)調(diào)節(jié)乙酸產(chǎn)量，進(jìn)而降低對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響。原因可能是乙酸的上升，酵母細(xì)胞不能維持胞質(zhì)膜電位平衡，導(dǎo)致細(xì)胞酸化，影響細(xì)胞代謝[17]。

2.4.2 出發(fā)菌株和重組菌株的高級(jí)醇生成量

按照傳統(tǒng)發(fā)酵工藝發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定出發(fā)菌株和重組菌株餾出液中高級(jí)醇的生成量，如圖7所示。與出發(fā)菌株a17相比，重組菌株的高級(jí)醇產(chǎn)量均有所下降。其中a-Ppgk1-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt7-A、a-Phxt1-A、a-Phxt2-A、a-Phxt5-A和a17-ΔB總高級(jí)醇分別下降52.36%、42.56%、37.84%、30.74%、22.29%、19.26%、16.72%和11.48%。重組菌株a-Ppgk1-A高級(jí)醇產(chǎn)量降低最多，苯乙醇、異戊醇、異丁醇、正丙醇分別降低45.67%、56.16%、48.55%、52.41%，總高級(jí)醇由592.31下降到280.65 mg/L。重組菌株a-Phxt3-A次之，苯乙醇、異戊醇、異丁醇、正丙醇分別降低37.03%、45.45%、38.69%、41.63%，總高級(jí)醇由592.31下降到340.47 mg/L。與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Phxts相比，強(qiáng)啟動(dòng)子Ppgk1過(guò)表達(dá)ALD6基因的菌株降低高級(jí)醇效果更為顯著，可能因?yàn)辄S酒發(fā)酵過(guò)程中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控ALD6基因的表達(dá)不如組成型啟動(dòng)子穩(wěn)定，或者其表達(dá)強(qiáng)度弱于組成型啟動(dòng)子[18]。

圖7 出發(fā)菌株和重組菌株的高級(jí)醇生成量Fig.7 Higher alcohols production of the original and recombinant strains

在6種HXT系列糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中Phxt3過(guò)表達(dá)ALD6基因的菌株降高級(jí)醇效果最顯著，這是因?yàn)辄S酒主發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖質(zhì)量濃度一般在25～75 g/L，Phxt3是中糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，故此糖度有利于啟動(dòng)子Phxt3調(diào)控ALD6的表達(dá)[19]。Phxt4與Phxt7過(guò)表達(dá)ALD6菌株降低高級(jí)醇效果次之，這可能因?yàn)閭鹘y(tǒng)黃酒補(bǔ)水發(fā)酵的最初階段發(fā)酵液中的葡萄糖濃度較低，在此階段誘導(dǎo)了啟動(dòng)子Phxt4和Phxt7調(diào)控ALD6基因的表達(dá)，但隨著原料的糖化發(fā)酵液中糖濃度提高，又抑制了其表達(dá)[20]。而Phxt2和Phxt5可能是因?yàn)槠浔旧韽?qiáng)度較弱使得ALD6基因表達(dá)相對(duì)較低，因此最后降低高級(jí)醇效果相對(duì)較弱。Phxt1過(guò)表達(dá)ALD6菌株降低高級(jí)醇效果最弱，這是因?yàn)閱?dòng)子Phxt1最適糖質(zhì)量濃度為90～130 g/L，黃酒發(fā)酵過(guò)程中無(wú)法達(dá)到該濃度[21]。

重組菌株高級(jí)醇生成量降低的原因可能是高級(jí)醇的前體物質(zhì)醛類可以被乙醛脫氫酶氧化生成有機(jī)酸，故醛類還原產(chǎn)生高級(jí)醇有所減少[22-23]。結(jié)合圖6、7，隨著重組菌株乙酸的上升，高級(jí)醇生成隨之降低，所以重組菌株高級(jí)醇降低的另一原因可能與其乙酸含量顯著上升有關(guān)，高濃度乙酸抑制細(xì)胞代謝，影響了酵母的生長(zhǎng)速率，因此，過(guò)表達(dá)ALD6可能是通過(guò)增加乙酸產(chǎn)量，抑制了酵母的生長(zhǎng)性能，進(jìn)而降低了高級(jí)醇含量。

3 結(jié)論

本研究在釀酒酵母中選用6個(gè)HXT系列糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Phxt1、Phxt2、Phxt3、Phxt4、Phxt5和Phxt7過(guò)表達(dá)乙醛脫氫酶基因ALD6構(gòu)建6個(gè)重組菌株a-Phxt1-A、a-Phxt2-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt5-A、a-Phxt7-A，對(duì)比了其與實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建重組菌株a-Ppgk1-A、出發(fā)菌a17的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能、乙酸及高級(jí)醇生成量，過(guò)表達(dá)ALD6基因使酵母產(chǎn)乙酸增多，影響酵母的生長(zhǎng)性能，但是糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子較Ppgk1可以適當(dāng)減弱其對(duì)酵母產(chǎn)生的負(fù)面影響。同時(shí)，在傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵體系中重組菌株還原糖余量均高于出發(fā)菌株，Ppgk1過(guò)表達(dá)ALD6基因?qū)戤a(chǎn)酒精能力影響較顯著，而Phxts幾乎不影響菌株的發(fā)酵性能。與出發(fā)菌株a17相比，重組菌株的高級(jí)醇產(chǎn)量均有所下降，其中a-Ppgk1-A、a-Phxt3-A、a-Phxt4-A、a-Phxt7-A、a-Phxt1-A、a-Phxt2-A、a-Phxt5-A總高級(jí)醇分別下降52.36%、42.56%、37.84%、30.74%、22.29%、19.26%和16.72%。綜上所述，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Phxt3過(guò)表達(dá)ALD6基因的重組菌株a-Phxt3-A降高級(jí)醇效果最好且對(duì)酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的影響相對(duì)較小。本研究采用動(dòng)態(tài)調(diào)控策略利用糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子初步解決了ALD6基因過(guò)表達(dá)對(duì)酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響，后續(xù)還需要擴(kuò)大發(fā)酵體系，優(yōu)化發(fā)酵工藝進(jìn)一步驗(yàn)證HXT系列糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控ALD6基因表達(dá)及其降高級(jí)醇的效果。