楊雪晨，付紹平，王麗霞，徐寧，徐超，劉光輝，馬振平，劉君*

1(天津科技大學 食品科學與工程學院，天津，300000)2(中國科學院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308)

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)作為二元羧酸，在生物體碳氮代謝中扮演重要角色，對糖、氨基酸和蛋白質(zhì)的合成也有重要作用[1-5]。α-KG同時還具有抗衰老的作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)[6-7]。傳統(tǒng)工業(yè)采用化學合成法生產(chǎn)α-KG[8]，使用大量化學試劑，嚴重污染環(huán)境。微生物發(fā)酵法存在副產(chǎn)物過多，發(fā)酵周期長等弊端。全細胞轉(zhuǎn)化法具有催化反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、反應(yīng)副產(chǎn)物少，產(chǎn)物易分離等優(yōu)點[9-10]，適合α-KG的分離提純。全細胞轉(zhuǎn)化體系存在殘留底物、雜蛋白、有機雜酸和色素等雜質(zhì)，且α-KG的親水性強、溶解度大，為后續(xù)的分離提純帶來困難。因此，高效率的轉(zhuǎn)化技術(shù)和合理的分離提純方法是生產(chǎn)α-KG的關(guān)鍵。

彭小雨等[11]發(fā)現(xiàn)鈣鹽沉淀法可以從含大量酮酸的發(fā)酵液中分離提純α-KG，王東陽等[12]發(fā)現(xiàn)Ca(OH)2作為中和劑會使發(fā)酵液中的α-KG鈣鹽沉淀反應(yīng)進行的更穩(wěn)定。也有較多文獻報道了離子交換法對有機酸的提取，如李寅等[13]采用離子交換法從發(fā)酵液中提取丙酮酸，占宏德等[14]采用離子交換法從發(fā)酵液中提取了α-KG。本文使用全細胞催化法生產(chǎn)α-KG[15]，應(yīng)用鈣鹽沉淀法作為分離提純α-KG的預(yù)處理步驟。α-KG鈣鹽的酸解過程具有不可逆的特點，但是酸解后的液體依然會含有少量的CaSO4、Ca(OH)2、α-KG鈣鹽等殘留。離子交換法具有提取效率高，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單等優(yōu)點[16]，并且可以去除酸解液中的鈣鹽雜質(zhì)。本文使用離子交換法對鈣鹽沉淀法處理后的料液進行更進一步的分離提純，采用動態(tài)吸附以及兩階段洗脫對α-KG鈣HCl水解液進行純化，對2種α-KG的分離方法進行結(jié)合，以期為α-KG轉(zhuǎn)化液的分離純化提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：DHG-9023A電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠公司；SX-500滅菌鍋，馭锘實業(yè)有限公司；有機玻璃型φ2.5 cm×45 cm離子交換層析柱，上海廈美生化科技發(fā)展有限公司；YRE-2010Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；Avanti J-26S XP落地式高速冷凍離心機，上海納锘實業(yè)公司；AL104-IC電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；1260 InfinityⅡ高效液相色譜，Agilent公司；MOF205中空纖維膜，天津膜天膜科技股份有限公司；ZJSP-11-025型10 kDa納濾膜，Merck Millipore公司。

試劑：離子交換樹脂D380、D301、D113、D201、719、732、717、296R，寧波爭光樹脂有限公司；α-KG轉(zhuǎn)化液，實驗室制備(發(fā)酵菌株：CgL0)；食品級活性炭，上海安譜實驗科技股份有限公司；α-KG標品試劑，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-KG全細胞轉(zhuǎn)化液預(yù)處理

轉(zhuǎn)化液預(yù)處理：大型冷凍離心機5 500 r/min離心后收取α-KG上清液，中空纖維膜過濾除固形物，10 kDa納濾膜除去大部分雜蛋白，再通過活性炭進行脫色，最后用HCl溶液調(diào)節(jié)母液pH=2.0，作為后續(xù)實驗的母液。

1.2.2 鈣鹽沉淀法粗分離α-KG

選取Ca(OH)2做沉淀劑，將母液pH調(diào)節(jié)至2.0后和過量的沉淀劑放入燒杯攪拌，用質(zhì)量分數(shù)為50%的Ca(OH)2調(diào)節(jié)溶液pH=8.0，使Ca(OH)2過量，保證α-KG與Ca(OH)2中和反應(yīng)完全。靜置一段時間后抽濾收集α-KG鈣鹽沉淀，量取濾液體積，收集中和后的鈣鹽，檢測濾液中α-KG的含量。將收集到的α-KG鈣沉淀加5 mmol/L H2SO4重懸，再用濃H2SO4調(diào)節(jié)溶液pH至1.0，抽濾收集酸解液，HPLC儀檢測酸解液中α-KG的含量和純度。

1.2.3 離子交換樹脂的預(yù)處理

陰離子樹脂預(yù)處理步驟：第一步，配制飽和NaCl溶液，取其量約等于被處理樹脂體積的3倍，將樹脂置于其中浸泡24 h，用去離子水漂洗，使排出的水不帶有黃色為止。第二步，配制5%(體積分數(shù))HCl溶液，取其量約等于被處理樹脂體積的3倍，將樹脂置于其中浸泡8 h(或作小容量清洗)，用純水漂洗至中性。第三步，配制質(zhì)量分數(shù)為5%的NaOH溶液，取其量約等于被處理樹脂體積的3倍，將樹脂置于其中浸泡8 h，用純水漂洗至中性。

1.2.4 最佳樹脂選型

對6種樹脂做靜態(tài)離子交換試驗，選擇吸附和洗脫效果較好的樹脂進行后續(xù)實驗。用去離子水水洗抽濾得到46 g抽干濕樹脂，放入250 mL的三角瓶內(nèi)并加入一定濃度的α-KG標準品溶液(每組2個平行)，室溫下靜置吸附處理26 h。吸附液取樣后用去離子水水洗抽濾，得到吸附后的樹脂濕重，取其中的40 g抽干濕樹脂加入2倍的洗脫劑洗脫26 h，取樣使用比色法檢測并根據(jù)公式(1)和(2)計算樹脂平衡時α-KG的吸附率和洗脫率。

(1)

(2)

式中：A，樹脂吸附率，%；E，樹脂洗脫率，%；ρ0，原液中α-KG質(zhì)量濃度，g/L；ρ1，吸附剩余液中α-KG質(zhì)量濃度，g/L；ρ2，洗柱液中的α-KG質(zhì)量濃度，g/L；ρ3，洗脫液中的α-KG質(zhì)量濃度，g/L；V0，原液中α-KG體積，mL；V1，吸附剩余液中α-KG體積，mL；V2，洗柱液中α-KG體積，mL；V3，洗脫液中的α-KG體積，mL。

1.2.5 洗脫劑的選擇

配制70 g/L的α-KG標準液記為溶液1，取110 g(D301)抽干濕樹脂，加入適量溶液1靜置過夜吸附，抽濾吸附液并用去離子水沖洗3個柱體積，取吸附后的抽干濕樹脂50 g并分裝于5個100 mL的三角瓶(每組2個平行)，加入1%、2%、3%、4%、5%HCl或NaOH(質(zhì)量分數(shù))梯度的溶液各30 mL作為洗脫液靜態(tài)洗脫24 h。通過不同質(zhì)量分數(shù)洗脫劑的洗脫效率來決定最佳的洗脫劑和洗脫劑的質(zhì)量分數(shù)。

1.2.6 固定床動態(tài)吸附與洗脫

離子交換柱采用玻璃層析柱(內(nèi)徑5.2 cm，外徑7 cm，高44 cm)，樹脂裝填量為100 mL。將預(yù)處理過的發(fā)酵液進行上樣，待樹脂吸附飽和后，用純水洗去柱中殘留的轉(zhuǎn)化液，然后用洗脫液進行洗脫。經(jīng)過3次獨立試驗后，采取等度洗脫策略，分別收集流出液、洗脫液，測定其中α-KG含量，分析α-KG的吸附效率和洗脫效率，對動態(tài)上樣和動態(tài)洗脫進行優(yōu)化，找到最優(yōu)的離子交換工藝參數(shù)。

1.2.7 分析檢測方法

對實際樣品的分離純化需要準確定量以及對純度進行分析，本文選擇HPLC法作為主要的檢測方式[1]，將待測樣品稀釋一定倍數(shù)，0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC檢測。流動相：5 mmol/L H2SO4溶液，用0.22 μm孔徑的微濾膜抽濾并脫氣。HPLC條件：Aminex HPX-87H色譜柱，柱溫65 ℃，進樣量10 μL，流量0.6 mL/min，檢測器紫外檢測器，檢測波長210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣鹽沉淀法提純α-KG

根據(jù)彭小雨[11]的研究結(jié)果可知CaCO3作為沉淀劑，α-KG的收率和純度相對較高，但是選擇CaCO3作為沉淀劑需要高溫水浴除CO2，而CaCl2在中和時會使Cl-富集不利于后續(xù)的離子交換。Ca(OH)2作為沉淀劑縮短了中和時間，并且中和時無大量氣體逸出、提高了設(shè)備利用率[17]，本文在進一步試驗后選擇了Ca(OH)2作為鈣鹽沉淀法預(yù)處理α-KG的沉淀劑，進行工藝開發(fā)。由圖1-a和圖1-b可知，α-KG在中和濾液中的含量明顯降低，同時不同雜質(zhì)HPLC的相對峰面積占比增加，說明大部分雜質(zhì)并沒有參與中和階段形成鈣鹽的反應(yīng)。由此可知α-KG與鈣離子的結(jié)合具有顯著特異性，中和階段α-KG母液與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生α-KG沉淀的過程有明顯的分離提純效果。

a-α-KG轉(zhuǎn)化液稀釋100倍；b-中和階段濾液稀釋10倍：c-酸解液稀釋100倍圖1 鈣鹽沉淀法各階段HPLC檢測峰圖Fig.1 Peak diagram of HPLC detection in each stage of calcium salt method

酸解過程利用了α-KG鈣在酸性條件下的解離常數(shù)隨著H+濃度的增高而增大的特性，在H2SO4存在的溶液中發(fā)生反應(yīng)，生成難溶于水的CaSO4沉淀，鈣鹽中的α-KG游離出來進入酸解液中。此反應(yīng)屬于不可逆反應(yīng)，因此H2SO4和α-KG鈣可以完全分解為α-KG和CaSO4。圖1-a和圖1-c表征了酸解后α-KG轉(zhuǎn)化液純度的提高，鈣鹽沉淀階段的α-KG收率為85.87%，α-KG的純度從78.79%提升至93.66%。但鈣鹽沉淀法在去除大量雜質(zhì)的同時，酸解液中也引入了未反應(yīng)完全的Ca(OH)2以及微溶于水中的CaSO4等鈣鹽雜質(zhì)，本文選擇通過離子交換法進一步除雜。

2.2 離子交換樹脂篩選實驗

采用靜態(tài)吸附和洗脫實驗對D380、D301、D201、719、296R、717等6種陰離子交換樹脂內(nèi)進行選型。6種樹脂對α-KG的吸附率和洗脫率結(jié)果如表1所示。

表1 樹脂的吸附和洗脫效果Table 1 Effects of adsorption and elution of resin

弱堿大孔型樹脂D301和D380對α-KG均有較強的吸附能力，但D301吸附α-KG的效果更好，也更容易洗脫，選擇D301作為后續(xù)離子交換工藝開發(fā)的填料。

2.3 洗脫劑的篩選試驗

通過靜態(tài)離子交換洗脫試驗，比較不同質(zhì)量分數(shù)的NaOH和HCl的洗脫α-KG樣品的效果，選取最合適的洗脫劑。洗脫效果如表2和圖2所示，可以看到質(zhì)量分數(shù)為5%的NaOH靜態(tài)洗脫率接近90%，本文選擇質(zhì)量分數(shù)為5%的NaOH作為洗脫劑進行后續(xù)離子交換實驗。當HCl質(zhì)量分數(shù)為1%時洗脫率僅為9.47%，且將洗脫液收集后進行旋蒸，蒸干水分后得到黃色透明膠狀的固體雜質(zhì)，難溶于水和有機溶劑。后續(xù)選擇質(zhì)量分數(shù)為0.02%的HCl進行實驗，收集的樣品旋蒸后依然出現(xiàn)該物質(zhì)。所以本文設(shè)計了一個離子交換前置洗脫實驗，用質(zhì)量分數(shù)為0.02%的HCl除去部分雜質(zhì)同時盡量減少α-KG損失。

表2 不同質(zhì)量分數(shù)洗脫劑的洗脫效率檢測Table 2 Elution efficiency tests with different mass concentrations of eluent

α-HCl洗脫；b-NaOH溶液洗脫圖2 不同洗脫劑的洗脫效果Fig.2 Elution effects of different eluents

后續(xù)再使用質(zhì)量分數(shù)為5%的NaOH充分洗脫目標產(chǎn)物，與此同時樹脂經(jīng)過酸洗和堿洗在分離目標產(chǎn)物的同時也間接進行了再生，固定樹脂床經(jīng)去離子水沖洗3倍柱體積后能再次投入使用。該方法簡化了樹脂再生流程，提高了生產(chǎn)效率和洗脫液中α-KG的純度。

2.4 動態(tài)上樣條件優(yōu)化實驗

2.4.1 不同上樣質(zhì)量濃度對動態(tài)吸附的影響

如圖3所示，雖然不同質(zhì)量濃度的上樣流出曲線的總體趨勢相似，但是在上樣質(zhì)量濃度為10和21 g/L的時候流出曲線拉平明顯，而上樣質(zhì)量濃度為43 g/L時穿透點提前，不利于樹脂床均勻地吸附。造成這些現(xiàn)象的主要原因可能是因為柱子體積較小，吸附容量有限所致。在實驗范圍內(nèi)，選擇31 g/L作為α-KG的上樣質(zhì)量濃度進行后續(xù)上樣優(yōu)化實驗。

圖3 不同上樣質(zhì)量濃度流出曲線Fig.3 Outflow curves for different loading concentrations

2.4.2 動態(tài)吸附上樣流速對流出曲線的影響

動態(tài)離子交換有一個重要的上樣參數(shù)，料液流經(jīng)已知體積的固定樹脂床所用的時間，即每小時流經(jīng)柱子的上樣液為床體積(bed volume,BV)的倍數(shù)，常用BV/h表示[18]。

高效的離子交換必須使固液兩相有充分的接觸時間，如果液相流速增加，固液接觸時間縮短，樹脂與上樣液來不及交換，就會導(dǎo)致交換區(qū)間拉長發(fā)生滲漏現(xiàn)象[19]。由圖4可知，在以8 BV/h的流速上樣時曲線拉平展開，而以4 BV/h和6 BV/h的流速上樣使穿透點提前，這都不利于樹脂的有效利用，造成上料的浪費，使生產(chǎn)成本進一步提高。在實驗范圍內(nèi)，選擇比較低的2.4 BV/h的流速作為上樣流速比較合理。

圖4 不同上樣流速的流出曲線Fig.4 Outflow curves for different loading flow rates

2.4.3 樹脂床裝填量高徑比對流出曲線的影響

在高徑比不同的條件下進行上樣，得到流出曲線(圖5)。

圖5 不同高徑比的流出曲線Fig.5 Outflow curves for different height to diameter ratios

分析流出曲線發(fā)現(xiàn)，不同的高徑比對流出曲線變化趨勢的影響較大。當高徑比為10∶1時，流出曲線坡度相對較緩，交換區(qū)域相對拉長造成吸附效率降低。高徑比為5∶1時，曲線出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，可能是由于隨著上樣進行樹脂吸附容量降低，當交換區(qū)間拉的過長時，會導(dǎo)致吸附能力減弱使曲線出現(xiàn)拖尾，還可能是由于樹脂裝填不嚴實所致。故在實驗范圍內(nèi)選擇2.5∶1的高徑比，吸附效率提高，有利于研究可以較好地進行。

2.5 動態(tài)洗脫實驗優(yōu)化

2.5.1 第一階段質(zhì)量分數(shù)為0.02%的HCl洗脫

上樣后使用質(zhì)量分數(shù)為0.02%等度洗脫2個柱體積，每10 mL取一次樣進行HPLC檢測，當取到350 mL樣品時停止。經(jīng)過檢測，發(fā)現(xiàn)收集到的樣品中α-KG含量很低不到母液的1%，α-KG的損失幾乎可以忽略。此步驟除去了一部分母液中的雜質(zhì)，使料液純度進一步提升，有利于后續(xù)實驗的進行。

2.5.2 第二階段質(zhì)量分數(shù)為5%的NaOH洗脫

通過第一階段的洗脫分離提純，第二階段本文使用質(zhì)量分數(shù)為5%的NaOH作為洗脫劑洗脫產(chǎn)物。觀察不同流速的動態(tài)洗脫曲線，判斷出最佳的洗脫流速，流出曲線如圖6所示。洗脫流速在3.4 BV/h和5 BV/h時雖然出峰時間早，但是洗脫峰較小收率低。高流速的洗脫可能使固液兩相接觸時間不足導(dǎo)致洗脫效率低，當洗脫流速在2 BV/h的時候洗脫峰較大且集中，收率較高，洗脫曲線拖尾不明顯，本文選擇2 BV/h的流速為最佳動態(tài)洗脫流速條件。

圖6 不同流速動態(tài)洗脫流出曲線Fig.6 Dynamic elution outflow curves for different flow rates

由圖7可知，以5%(質(zhì)量分數(shù))的NaOH溶液做洗脫劑，用2 BV/h的流速進行等度洗脫，最終料液的純度為97.32%。鈣鹽沉淀法和離子交換法結(jié)合的純化工藝總收率可以達到80.32%。

圖7 洗脫液HPLC檢測圖Fig.7 HPLC detection of the collected sample

3 結(jié)論與討論

目前，單獨使用離子交換法或鈣鹽沉淀法無法得到高純度的α-KG，若想提升α-KG的品質(zhì)，需采用一系列物理化學的組合方法進行分離提純[20]。通過鈣鹽沉淀法，使轉(zhuǎn)化液中的α-KG和Ca(OH)2進行中和反應(yīng)，形成α-KG鈣沉淀下來。在此過程中去除了中和濾液中的大量雜質(zhì)，α-KG鈣酸解后得到雜離子含量較少的α-KG酸解液。將鈣鹽沉淀法處理后的α-KG酸解液動態(tài)上樣到D301樹脂柱，去除鈣鹽沉淀法中引入的鈣鹽雜質(zhì)，經(jīng)過兩階段洗脫得到純凈的α-KG溶液。最終，α-KG的總收率可達80.32%，轉(zhuǎn)化液中α-KG的純度從78.79%提升至97.32%，為α-KG生物轉(zhuǎn)化液的精細分離提供了可行方法。該工藝對比已報道過的鈣鹽沉淀法和離子交換法等分離提取方法，可以獲得更高純度的α-KG。使用經(jīng)鈣鹽沉淀法去除大量雜質(zhì)的酸解液進行離子交換，對比用轉(zhuǎn)化液或者發(fā)酵液直接進行D301樹脂的上樣吸附，離子交換過程的洗脫效率得到明顯提升，并進一步提高了分離后的α-KG純度，適合工業(yè)化發(fā)展的需求。

雖然該工藝對α-KG的純化效果明顯、收率較高，但后續(xù)如果想進一步提高純度以滿足工業(yè)化的需求，需要設(shè)計α-KG陽離子樹脂脫鹽和重結(jié)晶工藝。目前嘗試過的陽離子樹脂分別為732、D001-X7、D113、D108，其中D113樹脂的脫鹽能力較好，后續(xù)會對該樹脂的脫鹽工藝進一步優(yōu)化。經(jīng)過陽離子樹脂脫鹽后，再添加有機溶劑進行重結(jié)晶，可進一步提升純度。