李茜，于文文，呂雪芹，劉延峰，李江華，堵國成，陳敬華*，劉龍*

1(江南大學(xué) 未來食品中心，江蘇 無錫，214122)2(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

β-葡聚糖是一種廣泛存在于真菌、藻類和細(xì)菌中的細(xì)胞壁多糖[1]。β-葡聚糖具有多種生理活性，如抗氧化[2]、抗輻射及抗炎抗腫瘤[3]等。β-葡聚糖作為有效的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可以刺激免疫系統(tǒng)[4]，常用于降低膽固醇，預(yù)防冠心病等。

目前，β-葡聚糖的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。其中，化學(xué)合成法主要采取金催化鄰炔基苯甲酸酯的糖苷化方法構(gòu)建糖苷鍵，合成β-1,3-葡聚糖[5]。相比化學(xué)合成法，生物合成法具有綠色環(huán)保的優(yōu)勢，可以在高效提高產(chǎn)量的同時(shí)，解決資源可持續(xù)化問題。與出芽短梗霉等其他微生物相比，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是典型真核模式菌株[6]，且β-葡聚糖在釀酒酵母細(xì)胞壁中的高占比(45%～55%)使其成為生物合成β-葡聚糖的最佳底盤細(xì)胞[7]。釀酒酵母中的β-葡聚糖主要由β-1,3糖苷鍵連接的吡喃葡萄糖主鏈，以及不同分布位置和長度的β-1,6糖苷鍵連接而成，其生物合成途徑如圖1所示。ZHOU等[8]在釀酒酵母中通過增加β-葡聚糖合成途徑關(guān)鍵酶的拷貝數(shù)，引入異源葡聚糖合酶以及改善細(xì)胞內(nèi)二磷酸尿苷(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖的含量等策略，將β-葡聚糖的產(chǎn)量提高了53.1%。這證明了關(guān)鍵前體UDP-葡萄糖的供應(yīng)對β-葡聚糖的產(chǎn)量至關(guān)重要。在木質(zhì)纖維素中，葡萄糖作為纖維素的成分之一，是最常見的單糖。而木糖作為半纖維素的主要成分，占木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的20%～40%[9]。共同利用木質(zhì)纖維素中的葡萄糖和木糖對于經(jīng)濟(jì)可行地生產(chǎn)生物燃料和化學(xué)品至關(guān)重要。SU等[10]使用代謝工程，利用木糖-葡萄糖混合發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，將其產(chǎn)量提高了2.6倍，實(shí)現(xiàn)類胡蘿卜素的綠色高效生產(chǎn)。

圖1 釀酒酵母中β-葡聚糖的合成途徑及木糖代謝途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of β-glucan and the construction of the metabolism pathway of xylose in S.cerevisiae

此外，β-葡聚糖的生物活性與其分子質(zhì)量具有高度的相關(guān)性。有研究表明，低分子質(zhì)量的β-葡聚糖具有更良好的生物活性[11-12]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，降低分子質(zhì)量的方式主要有酶法降解、超聲波降解法和酸降解等[13]。GAO等[14]在畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達(dá)了來源于哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶，并在與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)，成功將農(nóng)桿菌中的凝膠多糖水解成為低聚合度的凝膠寡糖。因此，酶解法可以替代傳統(tǒng)復(fù)雜的生產(chǎn)程序，簡單高效地生產(chǎn)低聚糖。

該文以釀酒酵母(S.cerevisiae)CEN.PK2-1C為原始菌株，首先對β-葡聚糖合酶及調(diào)控亞基的表達(dá)進(jìn)行強(qiáng)化，之后利用基因組多位點(diǎn)整合的方法增加前體UDP-葡萄糖的供應(yīng)，最后敲除競爭途徑基因alg5，引導(dǎo)更多UDP-葡萄糖流向β-葡聚糖合成途徑。采用木糖-葡萄糖共利用的策略，在引入木糖代謝途徑后，通過過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Hxt7(F79S)和敲除釀酒酵母中葡萄糖阻遏效應(yīng)的關(guān)鍵基因snf1，提高了木糖的消耗速率和β-葡聚糖的產(chǎn)量，最終S12中β-葡聚糖的產(chǎn)量為86.09 mg/g。最后，通過利用釀酒酵母自身的半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子系統(tǒng)[15]，控制內(nèi)切β-葡聚糖酶基因eng1表達(dá)，生成低分子質(zhì)量的β-葡聚糖。該研究在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了低分子質(zhì)量β-葡聚糖的高效綠色合成，對β-葡聚糖的經(jīng)濟(jì)可行生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

研究使用的菌株見表1。大腸桿菌(Escherichiacoli) JM109和DH5α用于重組DNA實(shí)驗(yàn)，SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C為本實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。菌株、質(zhì)粒全部保藏在本實(shí)驗(yàn)室。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，121 ℃滅菌 20 min。添加氨芐青霉素用以篩選，終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，115 ℃滅菌 20 min。

YPX培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，木糖 20，115 ℃滅菌 20 min。

YPDX培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，木糖 20，115 ℃滅菌 20 min。

Prime STAR (max) DNA聚合酶、DNA marker，TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶，南京諾唯贊生物科技有限公司；分子操作相關(guān)試劑盒，上海生工生物工程有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒與菌株構(gòu)建

來源于樹干畢赤酵母的木糖還原酶基因(xyl1)、木糖醇脫氫酶基因(xyl2)、木酮糖激酶基因(xyl3)為本實(shí)驗(yàn)室前期保存，釀酒酵母的啟動(dòng)子、目的基因和終止子片段均以S.cerevisiaeCEN PK2-1C基因組為模板擴(kuò)增，xyl1、xyl2、xyl3基因以質(zhì)粒pUC57-Amp-Xyl為模板擴(kuò)增。利用Gibson多片段組裝酶構(gòu)建質(zhì)粒，通過PCR及測序驗(yàn)證質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。通過融合基因序列的上游和下游構(gòu)建敲除框，利用CRISPR/Cas9技術(shù)整合或者敲除目標(biāo)基因，分別設(shè)計(jì)位于基因與同源臂序列上的引物，通過PCR驗(yàn)證基因是否被成功敲除或整合并測序驗(yàn)證。研究所用引物見表2。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

將重組菌接種到添加20 mL YPD/YPX/YPDX液體培養(yǎng)基中30 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h制備種子液，檢測OD600。當(dāng)OD600=0.5時(shí)將其轉(zhuǎn)接至含100 mL YPD液體培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃，220 r/min搖瓶培養(yǎng)120 h，檢測中間過程生長OD600、細(xì)胞干重及最終產(chǎn)物含量。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2.3 β-葡聚糖的提取和水解

利用堿提取法對細(xì)胞壁中的β-葡聚糖進(jìn)行提取。首先，將破碎后的細(xì)胞溶于60 g/L的NaOH溶液中，90 ℃水浴2 h，然后5 000 r/min離心15 min，沉淀部分用蒸餾水洗2～3次，重懸并在5 000 r/min離心15 min。最后，用體積分?jǐn)?shù)1% HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0，得到粗制的β-葡聚糖產(chǎn)品，4 ℃保存。

酵母β-葡聚糖樣品在65 ℃的恒溫干燥箱中干燥48 h。稱取10 mg樣品后，加入1 mL濃硫酸，充分混合，室溫下水解30 min。用高濃度的NaOH溶液將pH值調(diào)整到7.0，并加入蒸餾水將溶液定容到100 mL。取該溶液3 mL，以5 000 r/min離心15 min，上清液為β-葡聚糖的酸水解液。

1.2.4 檢測方法

發(fā)酵液中的葡萄糖、木糖以及β-葡聚糖酸水解液中的葡萄糖等使用HPLC進(jìn)行測定，儀器型號為Agilent 1260 Infinity。流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4溶液，進(jìn)樣體積為10 μL，色譜柱型號為Aminex?HPX-87H (300 mm×7.8 mm，250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫55 ℃，流速0.6 mL/min，示差折光檢測器，檢測器溫度35 ℃。

β-葡聚糖的分子質(zhì)量檢測：將提取出的β-葡聚糖樣品溶于二甲基亞砜中，利用高效尺寸排除色譜(high performance size exclusion chromatography, HPSEC)法測定β-葡聚糖的分子質(zhì)量。儀器型號為Agilent 1260 Infinity，色譜柱型號為Waters WAT011545，流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3，柱溫45 ℃，流速0.6 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡聚糖合成途徑的強(qiáng)化

在β-葡聚糖的生產(chǎn)中，β-葡聚糖合成酶作為關(guān)鍵酶發(fā)揮著重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)首先過表達(dá)了β-葡聚糖合成酶基因fks1和其調(diào)節(jié)亞基基因rho1。將fks1和rho1各增加1個(gè)拷貝數(shù)，獲得了菌株S1和S2。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，過表達(dá)以上2個(gè)基因?qū)е娄?葡聚糖的產(chǎn)量提高至38.16 mg/g，出發(fā)菌株的產(chǎn)量為28.3 mg/g，繼續(xù)增加至2個(gè)拷貝，發(fā)現(xiàn)S3中β-葡聚糖的產(chǎn)量并未明顯提升。猜測是因?yàn)樵讦?葡聚糖的合成過程中，前體UDP-葡萄糖供應(yīng)不足導(dǎo)致。

在代謝工程中，強(qiáng)化前體供給是一種常見的高效促進(jìn)目的產(chǎn)物合成的策略。在釀酒酵母中，β-葡聚糖的合成途徑如圖1所示，葡萄糖依次通過己糖激酶HXK1、磷酸葡萄糖變位酶PGM2和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UGP1作用合成前體UDP-葡萄糖，最終通過β-葡聚糖合成酶合成β-葡聚糖。因此，在菌株S2中，對β-葡聚糖合成的關(guān)鍵前體UDP-葡萄糖合成途徑中的基因進(jìn)行了強(qiáng)化，分別對ugp1、hxk1和pgm2這3個(gè)基因增加1個(gè)拷貝數(shù)，獲得了重組菌株S4、S5、S6。對以上菌株及對照菌株S2進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)S5中β-葡聚糖的產(chǎn)量提高至41.38 mg/g，對照菌株產(chǎn)量為38.16 mg/g。此結(jié)果證明，增加基因拷貝數(shù)有利于β-葡聚糖產(chǎn)量的提升，因此，繼續(xù)增加至多拷貝，獲得菌株S7、S8。如圖2-a所示，S7、S8的生長情況均有提升，其中S7生長情況最好，OD600為42.16。對比S7、S8中及β-葡聚糖的產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，S7中產(chǎn)量繼續(xù)提升至43.17 mg/g，相比S2提高了13.13%。S8中產(chǎn)量為43.15 mg/g，與S7無明顯差異。因此，選擇S7菌株進(jìn)行后續(xù)改造。在增加拷貝數(shù)后，β-葡聚糖產(chǎn)量雖然得到了提高，但并未達(dá)到理想效果，可能是因?yàn)閁DP-葡萄糖作為釀酒酵母的中間代謝產(chǎn)物，部分流向其他競爭途徑。

a-強(qiáng)化途徑基因；b-敲除途徑基因圖2 重組菌株中β-葡聚糖的產(chǎn)量及OD600分析Fig.2 β-Glucan production and the OD600in engineered strains

2.2 UDP-葡萄糖消耗途徑的阻斷

UDP-葡萄糖作為釀酒酵母中重要的中間代謝產(chǎn)物，它還可以參與糖原合成、蛋白質(zhì)糖基化等代謝途徑[16]。因此，還可以通過抑制其他競爭支路增加UDP-葡萄糖流向β-葡聚糖合成途徑的代謝通量。在S7的基礎(chǔ)上，分別單獨(dú)敲除了通向糖原合成途徑和蛋白質(zhì)糖基化途徑的關(guān)鍵酶基因glc3和alg5，得到了菌株S9和S10。結(jié)果如圖2-b所示，當(dāng)單獨(dú)敲除glc3基因時(shí)，β-葡聚糖的產(chǎn)量為44.52 mg/g；當(dāng)單獨(dú)敲除alg5基因時(shí)，β-葡聚糖的產(chǎn)量為49.07 mg/g，該結(jié)果表明弱化糖原合成途徑和蛋白質(zhì)糖基化途徑可以有效促進(jìn)β-葡聚糖的合成。其中S10的產(chǎn)量高于S9，證明敲除alg5基因更有利于β-葡聚糖產(chǎn)量的提高。為驗(yàn)證兩者同時(shí)敲除對β-葡聚糖產(chǎn)量的影響，在S9中對alg5基因進(jìn)行了敲除，獲得了重組菌株S11。經(jīng)過發(fā)酵驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，菌株S11的生長情況雖與S10無明顯差異，S11中β-葡聚糖的產(chǎn)量卻明顯低于菌株S10。上述結(jié)果證明，合理調(diào)控UDP-葡萄糖的代謝流分布可以提高β-葡聚糖的最終產(chǎn)量。

2.3 木糖-葡萄糖共利用對β-葡聚糖產(chǎn)量的影響

在自然界中，木糖和葡萄糖作為木質(zhì)纖維素中含量最多的2種單糖，具有來源廣泛、價(jià)格低廉、可持續(xù)再生的優(yōu)點(diǎn)。相比利用淀粉水解物來源的葡萄糖為碳源，同時(shí)利用木質(zhì)纖維素中的木糖和葡萄糖更綠色可持續(xù)。由于釀酒酵母無法利用木糖，因此需要在釀酒酵母中重構(gòu)木糖代謝途徑[17]。木糖代謝基因有眾多來源，本研究選擇了來源于樹干畢赤酵母(Scheffersomycesstipitis)的木糖還原酶基因(xyl1),木糖醇脫氫酶基因(xyl2)，木酮糖激酶基因(xyl3)，通過融合PCR將擴(kuò)增好的基因片段進(jìn)行融合。并通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至重組菌株S10中，分別在以葡萄糖或木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵，并利用HPLC檢測發(fā)酵液中木糖和葡萄糖的含量及β-葡聚糖的產(chǎn)量，結(jié)果如圖3所示。

a-菌株生長情況；b-糖消耗情況圖3 引入木糖代謝途徑對細(xì)胞生長和碳源消耗的影響Fig.3 Effects of constructing the xylose metabolic pathway on cell growth and sugar consumptions of strains

在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)，2株菌生長情況無明顯差異(圖3-a)。而在以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，表達(dá)xyl1，xyl2，xyl3后的菌株的生長情況比對照菌株更好，證明重組后的Sxyl菌株可以利用木糖。然而，Sxyl在發(fā)酵過程中，木糖消耗僅為4.02 g/L，培養(yǎng)基中的木糖并未得到完全利用，可能是因?yàn)獒劸平湍钢腥狈ξ焯寝D(zhuǎn)運(yùn)蛋白導(dǎo)致木糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率低(圖3-b)。為提高木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，在Sxyl基礎(chǔ)上，過表達(dá)對木糖具有高親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT7(F79S)[18]，獲得菌株SxylM。在以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵驗(yàn)證(圖4-a)，發(fā)現(xiàn)120 h內(nèi)SxylM消耗的木糖更多。將菌株Sxyl和SxylM置于YPDX培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵，如圖4-b所示，120 h內(nèi)菌株Sxyl木糖消耗量為5.28 g/L，而SxylM中的木糖消耗量為11.16 g/L，證明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT7(F79S)的表達(dá)提高了對木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[18]。同時(shí)，SxylM的OD600高于Sxyl，木糖的加入促進(jìn)了細(xì)胞生長。然而如圖4-b、4-c所示，由于釀酒酵母偏好葡萄糖作為碳源，存在葡萄糖阻遏效應(yīng)，因此當(dāng)葡萄糖接近耗盡時(shí)，細(xì)胞才開始利用木糖。為解決上述問題，本研究對葡萄糖阻遏效應(yīng)中的關(guān)鍵基因snf1進(jìn)行了敲除，獲得菌株S12。如圖4-b～圖4-d所示，在菌株S12中，snf1基因的敲除使葡萄糖利用速率降低，木糖消耗速率升高，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖-木糖共利用，并將β-葡聚糖的產(chǎn)量提高至86.09 mg/g。

a-木糖唯一碳源中的糖消耗情況；b-混合碳源中的木糖消耗情況；c-混合碳源中的葡萄糖消耗情況；d-不同菌株中的β-葡聚糖產(chǎn)量圖4 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT7(F79S)和snf1基因?qū)μ荚聪募唉?葡聚糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of HXT7(F79S) and snf1 on the sugar consumption and production of β-glucan

β-葡聚糖高產(chǎn)菌株S12與野生型菌株S.cerevisiaeCEN PK2-1C(WT)的相對mRNA表達(dá)水平如圖5所示。

圖5 多基因優(yōu)化后各基因表達(dá)水平變化Fig.5 The changes on relative mRNA expression of targeted genes by multigene expression optimization

其中，基因alg5、snf1在敲除后，其mRNA表達(dá)水平降低。合成途徑基因fks1、hxk1、rho1、pgm2、ugp1在過表達(dá)后，mRNA的表達(dá)水平提升，表達(dá)量分別是野生型菌株的4.25、4.98、5.06、13.21、3.64倍。重組菌株S12的產(chǎn)量同樣高于野生型菌株，與mRNA結(jié)果相一致。

2.4 內(nèi)切β-葡聚糖酶的調(diào)控

在獲得了β-葡聚糖的高產(chǎn)菌株后，利用HPSEC檢測重組菌株S12中的β-葡聚糖分子質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)酵母β-葡聚糖的平均分子質(zhì)量高達(dá)1×106～2×106g/mol。β-葡聚糖的高分子質(zhì)量導(dǎo)致其溶解度降低，在食品、生物醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用受限。釀酒酵母中存在可以水解β-1,3-糖苷鍵的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶ENG1[19]，與引入異源水解酶相比，利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶動(dòng)態(tài)調(diào)控的策略更為簡單高效。

由于內(nèi)切β-葡聚糖酶的分泌與細(xì)胞生長周期相關(guān)，只在G1期表達(dá)。為避免內(nèi)切β-葡聚糖酶的表達(dá)對細(xì)胞生長產(chǎn)生不利影響，該實(shí)驗(yàn)選擇半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pgal1，對內(nèi)切β-葡聚糖酶的表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控[15]。在細(xì)胞發(fā)酵后期，加入20 g/L半乳糖誘導(dǎo)內(nèi)切β-葡聚糖苷酶表達(dá)并分泌至胞外，水解細(xì)胞壁中的β-葡聚糖，降低分子質(zhì)量。通過HPSEC檢測，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖的分子質(zhì)量降低至1.26×105g/mol(圖6)。上述結(jié)果表明，內(nèi)切β-葡聚糖酶可以降低細(xì)胞壁中β-葡聚糖的分子質(zhì)量，進(jìn)而增加β-葡聚糖的溶解度。

a-內(nèi)切β-葡聚糖酶的調(diào)控表達(dá)；b-HPSEC檢測β-葡聚糖的分子質(zhì)量圖6 重組菌株S13中β-葡聚糖的分子質(zhì)量Fig.6 Molecular weight of β-glucan in S13

3 結(jié)論與討論

β-葡聚糖在食品和醫(yī)藥工業(yè)都具有重要的應(yīng)用前景，因此，構(gòu)建高產(chǎn)β-葡聚糖的工程菌株具有重要意義。本研究選擇β-葡聚糖在細(xì)胞壁中占比較高的釀酒酵母為底盤細(xì)胞，首先通過強(qiáng)化β-葡聚糖合成途徑的基因fks1、rho1，實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵酶β-葡聚糖合成酶的高效表達(dá)；其次通過過表達(dá)hxk1、ugp1、pgm2基因，增加了重要前體UDP-葡萄糖的供應(yīng)，最后敲除了alg5基因，阻斷了UDP-葡萄糖的其他消耗途徑，提高了UDP-葡萄糖至β-葡聚糖的代謝通量，篩選出高產(chǎn)β-葡聚糖的菌株S12。有研究表明，對木質(zhì)纖維素中的葡萄糖-木糖共利用可以經(jīng)濟(jì)可行地實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的高效合成。因此，我們利用代謝工程技術(shù)，引入了木糖異構(gòu)途徑，并成功實(shí)現(xiàn)了酵母對木糖和葡萄糖的共利用，最終將β-葡聚糖的產(chǎn)量提高至86.09 mg/g。在此基礎(chǔ)上，利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在發(fā)酵后期調(diào)控酵母內(nèi)源β-葡聚糖苷酶基因eng1的表達(dá)，對現(xiàn)有菌株中β-葡聚糖的分子質(zhì)量進(jìn)行了改造，使其從1×106～2×106g/mol降低到1.26×105g/mol，成功生產(chǎn)出低分子質(zhì)量的β-葡聚糖。綜上，實(shí)驗(yàn)利用了代謝工程的策略，提高了β-葡聚糖的產(chǎn)量，并降低了它的分子質(zhì)量，為接下來β-葡聚糖的高效合成奠定了基礎(chǔ)。