楊志霞，黃 裕，王 丹

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437)

干燥綜合征是一種以侵犯唾液腺、淚腺等外分泌腺為主的慢性自身免疫性疾病，外周血中毒蕈堿受體3(muscarinic receptor，M3R)抗體及SSA、SSB、抗α-胞襯蛋白(α-fodrin)抗體均是診斷該病的特異性抗體[1]?；颊吲R床主要表現(xiàn)為口干、眼干，累及內(nèi)臟時(shí)可導(dǎo)致間質(zhì)性肺炎、遠(yuǎn)端腎小管酸中毒、肝功能異常等。目前干燥綜合征的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究發(fā)現(xiàn)口干癥狀的出現(xiàn)與患者唾液腺水分子通道蛋白-5(aquaporin protein-5, AQP5)的異常表達(dá)有關(guān)[2]。中醫(yī)典籍中并無干燥綜合征病名的記載，1989年路志正教授提出“燥痹”作為干燥綜合征的中醫(yī)對(duì)應(yīng)病名[3-4]。該病西醫(yī)主要采用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等全身免疫調(diào)節(jié)藥物治療，但只限定于活動(dòng)期的系統(tǒng)受累的干燥綜合征患者。與西藥治療相比，中藥治療更能有效緩解干燥綜合征患者的口眼干燥及臨床總體癥狀，控制病情進(jìn)展，增加唾液和淚液流率[5]，尤其是輕型干燥綜合征患者，可采用單純中藥治療。酸甘化陰法是目前中醫(yī)常用的治療方法，張仲景《傷寒論》中的芍藥甘草湯是酸甘化陰法的代表方劑。相關(guān)研究證實(shí)芍藥甘草湯能上調(diào)干燥綜合征模型大鼠頜下腺中 AQP5 的表達(dá)[6]，但具體機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同比例藥物配比的芍藥甘草湯對(duì)NOD小鼠唾液腺中AQP5、M3R及外周血干燥綜合征特異性抗體的影響，探討酸甘化陰法治療干燥綜合征的可能起效機(jī)制，并為處方進(jìn)一步優(yōu)化提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 近交系SPF級(jí)NOD雌性小鼠75只，8周齡，體重18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[動(dòng)物合格證號(hào)： SCXK(滬)2012-0002]。小鼠在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房中隔離飼養(yǎng)，溫度18～ 22 ℃，濕度50%～60%，光照周期12/12 h。該實(shí)驗(yàn)通過了上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 芍藥甘草湯：白芍12 g、生甘草6 g(2∶1)為低劑量，白芍18 g、生甘草6 g(3∶1)為中劑量，白芍30 g、生甘草6 g(5∶1)為高劑量，根據(jù)人的用量換算成小鼠用量：小鼠給藥量(g/kg)=人用劑量×0.002 6×50(g/kg)， 由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室制備，合生藥濃度1 g/mL。 毛果蕓香堿注射液：山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，規(guī)格：0.1 g/支，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院西藥房提供。

1.3試劑及儀器 蘇木精-伊紅(HE)試劑盒購(gòu)珠海貝索生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：2018001)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗和PNP顯色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：2018002)；小鼠抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào)：2018006)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：2018006)；SYBRPremix Ex TaqⅡ試劑盒購(gòu)自上?？針飞锟萍加邢薰?批號(hào)：2018008)。紫外可見分光光度計(jì)(ELX800，Bio-Teck)；正置顯微鏡(BX51，Olympus)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組各15只。芍藥甘草湯低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度芍藥甘草湯19.5 g/kg灌胃，同時(shí)給予生理鹽水腹腔注射，1次/d；毛果蕓香堿組給予毛果蕓香堿注射液1.4 mg/kg腹腔注射，1次/d；生理鹽水組給予生理鹽水灌胃，1 次/d。各組均連續(xù)干預(yù)6周。

1.5標(biāo)本采集 干預(yù)結(jié)束后，采用腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉小鼠，眼球采血，置于普通抗凝管中，離心收集血清，并在-80 ℃下保存。處死各組小鼠，取頜下腺，一側(cè)頜下腺采用10%福爾馬林固定制備石蠟切片，一側(cè)頜下腺-80 ℃凍存。

1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1頜下腺的病理形態(tài) 取各組小鼠頜下腺石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水后，將切片置于蘇木素中染色10 min，后用流動(dòng)水沖洗10 min左右，待組織塊變藍(lán)后置于伊紅中染色3 min。取出切片，進(jìn)行梯度乙醇脫水(95%無水乙醇1 min，95%無水乙醇1 min ，無水乙醇1 min，無水乙醇45 s)，二甲苯清除。樹膠封片，置通風(fēng)櫥中晾干，顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)。

1.6.2頜下腺中AQP5及M3R mRNA表達(dá)情況 采用real-time PCR法檢測(cè)：取凍存的各組小鼠頜下腺，按照Trizol說明書分離頜下腺組織或腺泡細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物采用primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，AQP5的上游引物為5’-CTCGCAACGCAGTATCTCA AGT-3’，下游引物為5’-GCCATCTATCCCTCTCCTGAAG-3’，M3R 的上游引物為5’-GTTACCCTCATCGGACAACCT-3’，下游引物為5’-TTACCCACTGAGGAGTTGACG-3’，采用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH) 作為內(nèi)部參照。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。PCR的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，用2-△△Ct法計(jì)算AQP5 及M3R mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6.3血清中特異性抗體含量 取各組小鼠血清，按試劑盒提供的操作流程，用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin抗體含量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠頜下腺HE染色病理形態(tài) 生理鹽水組和毛果蕓香堿組NOD小鼠頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；芍藥甘草湯各劑量組小鼠淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶明顯減少，其中芍藥甘草湯高劑量組僅可見少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 各組 NOD小鼠頜下腺HE染色病理形態(tài)(×200)

2.2各組小鼠頜下腺中AQP5及M3R mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 芍藥甘草湯各組AQP5及M3R mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于生理鹽水組(P均<0.05)，毛果蕓香堿組與生理鹽水組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；芍藥甘草湯中劑量組AQP5及M3R mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于芍藥甘草湯低劑量組(P均<0.05)，且AQP5 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于芍藥甘草湯高劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組NOD小鼠頜下腺中AQP5及M3R mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3各組小鼠外周血中抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin抗體含量比較 與生理鹽水組比較，毛果蕓香堿組和芍藥甘草湯各組血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗體含量均明顯降低(P均<0.05)，血清中抗M3R抗體含量均明顯升高(P均<0.05)；芍藥甘草湯中、高劑量組血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗體含量均明顯低于毛果蕓香堿組和芍藥甘草湯低劑量組(P均<0.05)，且芍藥甘草湯高劑量組均明顯低于芍藥甘草湯中劑量組(P均<0.05)；芍藥甘草湯中、高劑量組血清中抗M3R抗體含量均明顯高于毛果蕓香堿組和芍藥甘草湯低劑量組(P均<0.05)，且芍藥甘草湯高劑量組明顯高于芍藥甘草湯中劑量組(P<0.05)；芍藥甘草湯低劑量組血清中抗SSA、α-Fodrin抗體含量與毛果蕓香堿組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，血清中抗SSB抗體含量低于毛果蕓香堿組(P<0.05)，血清中抗M3R抗體含量明顯高于毛果蕓香堿組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組 NOD小鼠外周血中抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin抗體含量

3 討 論

干燥綜合征起病于燥，故大多數(shù)醫(yī)家根據(jù)“諸澀枯涸，皆屬于燥”的觀點(diǎn)，將其歸于“燥證”范疇。燥證病因多端，病機(jī)復(fù)雜，《雜病源流犀燭》中云 “燥之為病，皆陽實(shí)陰虛，血液衰耗所致也”，提示該病根本在于陰血虧耗，津液不足，而失去了它的滋潤(rùn)濡養(yǎng)之功，呈現(xiàn)一派干燥焦枯之象，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)描述的干燥綜合征患者眼干、口干之癥相符合。

酸甘化陰法為張仲景首創(chuàng)，是指將酸味藥與甘味藥配伍，按異類相使的配伍原則，達(dá)到滋陰養(yǎng)血生津作用的一種治法，代表方劑為芍藥甘草湯，用于治療干燥綜合征可使其久虧之陰得以自復(fù)，陰液漸充而燥象漸消，諸癥可緩。從五味歸經(jīng)角度分析，酸甘兩味藥具有“酸先入肝，甘先入脾”的特征，酸味藥入肝而能補(bǔ)肝體以制肝用，甘味藥入脾而能補(bǔ)益脾胃，有甘緩養(yǎng)胃、調(diào)肝緩急之功，兩者合用，產(chǎn)生“酸得甘助而生陰”的效果；從五臟開竅角度來講，肝開竅于目，在液為淚，淚從目出；脾開竅于口，在液為涎，且脾主運(yùn)化，具有運(yùn)化水谷精微及水液的作用，與唾液的分泌密切相關(guān)。酸甘化陰法將藥物歸經(jīng)理論和臟腑理論完美結(jié)合，以養(yǎng)脾胃津液和補(bǔ)肝陰。課題組前期研究證實(shí)以酸甘化陰法組方治療干燥綜合征，可有效緩解患者口干、眼干、便秘等主要臨床癥狀，降低免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)水平，調(diào)節(jié)自身免疫[7]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了其作用機(jī)制。

AQP5是最早被確定分布在唾液腺泡細(xì)胞腺泡腔的頂膜、側(cè)膜及導(dǎo)管上皮細(xì)胞中，能特異性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水的蛋白[8-9]，唾液腺中蛋白激酶C( PKC)、cAMP、蛋白激酶A(PKA)幾種刺激分泌的關(guān)鍵因子均通過作用于 AQP5 從而影響唾液腺的分泌[10-11]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，敲除 AQP5 基因的大鼠經(jīng)毛果蕓香堿刺激后，其唾液分泌量減少了 60% 以上，證實(shí)唾液流率與 AQP5 在涎腺中的表達(dá)量顯著相關(guān)[12-13]。AQP5在胞內(nèi)PKA介導(dǎo)的磷酸化作用下，可產(chǎn)生快速“閘門”效應(yīng)，使水分子經(jīng)過質(zhì)膜向高滲方向快速移動(dòng)，但其水轉(zhuǎn)運(yùn)能力受其表達(dá)數(shù)量和表達(dá)位置(功能性水通道數(shù)目)的影響[14]，如果腺體上皮細(xì)胞中缺乏AQP5，則其水轉(zhuǎn)運(yùn)能力會(huì)發(fā)生異常，使得唾液流率下降，產(chǎn)生口干的癥狀[15-16]。肖林等[17]發(fā)現(xiàn)在干燥綜合征患者唇腺中，AQP5在腺泡頂膜表達(dá)減少，而基側(cè)膜表達(dá)增強(qiáng)，這種表達(dá)部位的“易向”可能是AQP5將水分從腺泡細(xì)胞頂膜向基側(cè)膜逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，使唾液分泌減少，產(chǎn)生口干癥狀的原因。

M3R是一種單鏈跨膜糖蛋白，主要分布于外分泌腺，影響著唾液腺的液體分泌[18]。干燥綜合征患者外周血中存在M3R抗體，其與患者的唾液腺分泌功能障礙密切相關(guān)[19]。AQP5是 M3R 調(diào)節(jié)唾液分泌的效應(yīng)蛋白之一，抗M3R抗體可定向攻擊M3R受體，導(dǎo)致M3R與毒蕈堿結(jié)合減少，不能進(jìn)一步激活胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，使得AQP5磷酸化受限，影響其水轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而抑制原發(fā)性干燥綜合征患者腺體分泌，產(chǎn)生口干、眼干癥狀[20-21]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，芍藥甘草湯各劑量組小鼠淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶較少，唾液腺中AQP5及M3R mRNA相對(duì)表達(dá)量和血清中抗M3R抗體含量明顯升高，血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗體含量明顯降低；芍藥甘草湯中劑量組AQP5及M3RmRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于芍藥甘草湯低劑量組，且AQP5 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于芍藥甘草湯高劑量組；芍藥甘草湯高劑量組血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗體含量均明顯低于芍藥甘草湯低、中劑量組，血清中抗M3R抗體含量均明顯高于芍藥甘草湯低、中劑量組。提示酸甘化陰法組方芍藥甘草湯可通過上調(diào)NOD小鼠唾液腺中AQP5及M3R的表達(dá)，降低血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗體含量，改善腺體分泌能力，緩解口干癥狀，且芍藥甘草湯中、高劑量對(duì)干燥綜合征靶器官中的目標(biāo)蛋白影響更為顯著，這為后續(xù)進(jìn)一步優(yōu)化處方提供了依據(jù)。但芍藥甘草湯是復(fù)方制劑，其改善腺體分泌能力的起效機(jī)制復(fù)雜，也可能與阻斷M3R所介導(dǎo)的一系列免疫反應(yīng)有關(guān)，也可能從其他機(jī)制調(diào)節(jié)，還需進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。