張奮搏，陳瓊，蔣濤，焦迎春

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016）

青稞（Hordeum vulgareLinn.var.nudumHook.F.），又名裸大麥，是青藏高原特有的大麥變種[1]。青稞中含有β-葡聚糖、γ-氨基丁酸等活性物質(zhì)，其中β-葡聚糖具有預(yù)防高血壓、調(diào)節(jié)血糖和膽固醇的作用，能夠改善腸道環(huán)境和胰島素敏感性，降低直腸癌和心血管疾病發(fā)病率[2-4]；γ-氨基丁酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，對腦損傷具有一定的保護(hù)作用，也具有抗癌等活性功能[5]，因此青稞中的β-葡聚糖和γ-氨基丁酸是具有開發(fā)潛力的食品功能因子。藏靈菇（Tibetan Kefir）用于發(fā)酵牛乳制備酸奶，發(fā)酵過程中形成的富有彈性的乳白色菜花或米粒狀團(tuán)塊[6]，主要由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等多種微生物組成，具有改善腸道菌群、抗感染、降血脂等諸多益生作用。由藏靈菇制備的發(fā)酵乳與傳統(tǒng)酸乳在風(fēng)味、口感和質(zhì)地等品質(zhì)特征方面有明顯差異，是一種良好的生物發(fā)酵劑[7]。

青稞中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸天然存在含量低，很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；陌l(fā)展，因此需要對青稞中現(xiàn)有的β-葡聚糖和γ-氨基丁酸進(jìn)行有效的富集，目前富集青稞中β-葡聚糖跟γ-氨基丁酸的方法有很多，比如發(fā)酵法、混合菌發(fā)酵法、添加酶制劑法以及超聲波處理等[8]，混合菌發(fā)酵將兩種在發(fā)酵特征上具有互補(bǔ)性的菌進(jìn)行混合以彌補(bǔ)單一菌種發(fā)酵的不足，但該方法要考慮菌種的生長周期是否相同，產(chǎn)物是不是對另一種菌種產(chǎn)生抑制作用等[6]；添加酶制劑法可以參與植物體內(nèi)多種生理活動，但該方法對酶制劑要求高，成本高[10]；超聲波處理法則將植物處理后還需要進(jìn)一步純化出β-葡聚糖、γ-氨基丁酸，實(shí)驗(yàn)步驟較長。而發(fā)酵法具有成本低，富集含量高的特點(diǎn)，并且具有發(fā)酵速度快、安全性高、發(fā)酵周期短等特點(diǎn)，是一種安全且高效的方法。目前對藏靈菇的研究還很少，大部分研究是對藏靈菇菌種所含菌群進(jìn)行分離鑒定以及功能測定[11]。也有部分學(xué)者對藏靈菇菌種發(fā)酵酸奶工藝的研究，但是針對藏靈菇發(fā)酵青稞的研究很少。

綜上所述，本研究采用青藏高原特色作物青稞為原料，藏靈菇作為發(fā)酵劑，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計，以β-葡聚糖、γ-氨基丁酸的得率為指標(biāo)對青稞中β-葡聚糖和γ-氨基丁酸的富集工藝進(jìn)行研究，旨在為青稞中營養(yǎng)物質(zhì)的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：青稞購自青海省互助縣；藏靈菇為青海大學(xué)農(nóng)牧實(shí)驗(yàn)樓保藏。

主要儀器：WDP-450 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；400Y 多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；YM50 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；LR10M 大容量冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；DHG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司。

主要試劑：硼酸、重蒸酚、無水乙醇、次氯酸鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純，β-葡聚糖標(biāo)品、γ-氨基丁酸標(biāo)品，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)處理

（1）青稞處理：清理掉青稞中的沙石、泥塊、麥殼等，將泥土、沙塵清洗后放在電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，待青稞冷卻后，粉碎。

（2）菌種活化：將藏靈菇放入篩筐中來回晃動，將牛乳篩出去，用涼開水反復(fù)沖洗干凈，將清洗好的藏靈菇放入干凈的容器中，倒入純牛奶，并淹沒藏靈菇，而后將容器用紗布封好，置于室溫下活化，每隔24 h 換一次牛奶。

（3）培養(yǎng)基制備：將粉碎好的青稞與水按一定的料液比加入錐形瓶中制成青稞培養(yǎng)基，封口后在121℃、15 min 下進(jìn)行高溫滅菌。

（4）發(fā)酵：將活化好的菌種按設(shè)定的接種量接入青稞培養(yǎng)基中，按設(shè)定溫度和時間進(jìn)行發(fā)酵。

（5）離心、測吸光值：發(fā)酵至一定時間后，進(jìn)行離心操作，在4 000 r/min 的條件下離心10 min，然后取離心后的上清液，備用，以測定β-葡聚糖標(biāo)品和γ-氨基丁酸含量。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1β-葡聚糖測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：參照劉新琦等[12]測β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，得到回歸方程：y=6.664x+0.222，R2=0.999。

樣品得率測定：取發(fā)酵液5 mL 放入離心管，4 000 r/min 離心10 min，取離心后上清液2 mL，樣品在550 nm 處的吸光度值按上述方法測量，根據(jù)回歸方程計算樣品β-葡聚糖含量。按下式計算樣品中β-葡聚糖得率：

式中：

X——β-葡聚糖得率，%；

m1——β-葡聚糖含量，mg/g；

V——上清液體積，mL；

m2——青稞粉質(zhì)量，g。

1.2.2.2γ-氨基丁酸測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：按照劉棟等[13]測定γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，得到回歸方程：

y=1.92x-0.006 2，R2=0.996 5。

樣品得率測定：取發(fā)酵液5 mL 放入離心管，4 000 r/min 離心10 min，取離心后上清液2 mL，樣品在645 nm 處的吸光度值按上述方法測量，根據(jù)回歸方程，計算樣品γ-氨基丁酸含量。按如下公式計算樣品γ-氨基丁酸得率：

式中：

Y——γ-氨基丁酸得率，%；

m1——γ-氨基丁酸含量，mg/g；

V——上清液體積，mL；

m2——青稞粉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計

1.2.3.1 料液比對青稞中活性物質(zhì)的影響

分別設(shè)置β-葡聚糖料液比（m/V）為1:15、1:20、1:25、1:30、1:35；γ-氨基丁酸料液比為1:20、1:25、1:30、1:35、1:40，發(fā)酵溫度為20 ℃，發(fā)酵時間24 h，測定發(fā)酵液中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸的得率，研究不同料液比分別對青稞中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸得率的影響，確定最佳料液比。

1.2.3.2 接種量對青稞中活性物質(zhì)的影響

分別設(shè)置接種量（m/m）梯度為2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%，保持料液比為1:30，發(fā)酵溫度20 ℃，發(fā)酵時間24 h，測定發(fā)酵液中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸的得率，研究不同接種量對青稞中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸的得率的影響，確定最佳接種量。

1.2.3.3 發(fā)酵時間對青稞中活性物質(zhì)的影響

分別設(shè)置β-葡聚糖發(fā)酵時間梯度為12、24、36、48、60 h，γ-氨基丁酸發(fā)酵時間梯度為4、6、8、10 12 h，各保持料液比為1:30，接種量5%（m/m），發(fā)酵溫度20 ℃，測定發(fā)酵液中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸得率，研究不同發(fā)酵時間對青稞中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸得率的影響，確定最佳發(fā)酵時間。

1.2.3.4 發(fā)酵溫度對青稞中活性物質(zhì)的影響

分別設(shè)置發(fā)酵溫度梯度為25、32、37、40、45 ℃，保持料液比為1:30，接種量為5%（m/m），發(fā)酵時間24 h，測定發(fā)酵液中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸的得率，研究不同發(fā)酵溫度對青稞中β-葡聚糖、γ-氨基丁酸的得率的影響，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為考察因素，通過軟件Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計，設(shè)計因素與水平見表1、表2。

表1 β-葡聚糖響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 β-glucan response surface test factors and levels

表2 γ-氨基丁酸響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 2 Response surface test factors and levels of γ-aminobutyric acid

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Origin 2018 作圖分析，SPSS 23.0 進(jìn)行顯著性分析，Design-Expert 8.0.6 軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對青稞中活性物質(zhì)的影響

藏靈菇發(fā)酵青稞富集β-葡聚糖的最佳料液比為1:25。由圖1a 可以看出，藏靈菇發(fā)酵青稞的過程中β-葡聚糖的得率隨著料液比的減小呈先升高后降低的趨勢，β-葡聚糖的得率在料液比為1:25 時達(dá)到最大值30.25%，相對于最低料液比，提高了1.52 倍，差異顯著（p＜0.05）。這可能是因?yàn)榱弦罕忍?，?葡聚糖無法完全溶解，但是料液比太大，增加了水的消耗，因此選擇富集β-葡聚糖的最佳料液比為1:25，這與康田田等[14]報道的發(fā)酵后青稞中β-葡聚糖含量變化結(jié)果稍有不同，該研究中β-葡聚糖含量隨著料液比呈先增加后減少的趨勢，而β-葡聚糖含量在達(dá)到一定值后趨于穩(wěn)定，可能是因?yàn)樵喜煌?，發(fā)酵劑不同。藏靈菇發(fā)酵青稞富集γ-氨基丁酸的最佳料液比為1:30。由圖1b可以看出，藏靈菇發(fā)酵青稞的過程中γ-氨基丁酸的得率隨著料液比的減小呈先升高后降低的趨勢，γ-氨基丁酸的得率在料液比為1:30 時達(dá)到最大值39.08%，相對于最低料液比，提高了1.45 倍，差異顯著（p＜0.05）。這可能是因?yàn)榱弦罕鹊拇笮绊懓l(fā)酵系統(tǒng)的供氧，料液比低時供氧效果好，增加了菌體的流動性；料液比高時供氧效果較差，氣體交換效果差，因此選擇富集γ-氨基丁酸的最佳料液比為1:30。

圖1 料液比對β-葡聚糖(a)、γ-氨基丁酸得率(b)的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of β-glucan (a) and γ-aminobutyric acid (b)

2.1.2 接種量對青稞中活性物質(zhì)的影響

藏靈菇發(fā)酵青稞富集β-葡聚糖的最佳接種量為5%。由圖2a 可以看出，藏靈菇發(fā)酵青稞的過程中，β-葡聚糖得率呈先升高后降低的趨勢，β-葡聚糖的得率在接種量為5%時達(dá)到最大值35.37%，相較于最低接種量，提高了2.06 倍，差異顯著（p＜0.05）。這可能是因?yàn)?%的接種量下，發(fā)酵液已經(jīng)達(dá)到了飽和程度，因此選擇富集β-葡聚糖的最佳接種量為5%，這與劉新琦等[12]報道的發(fā)酵后青稞中β-葡聚糖含量隨著接種量的增多先增加后減少的變化一致。藏靈菇發(fā)酵青稞富集γ-氨基丁酸的最佳接種量為5%。由圖2b 可以看出，藏靈菇發(fā)酵青稞的過程中γ-氨基丁酸的得率隨著接種量的減小呈先升高后降低的趨勢，在接種量為5%時，γ-氨基丁酸的得率達(dá)到最大值54.02%，相對于最低接種量，提高了1.57 倍，差異顯著（p＜0.05）。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能接種量小時，菌體的適應(yīng)期和對數(shù)期會相對延長，菌體在生長繁殖階段的發(fā)酵能力較差，導(dǎo)致含量較低；而當(dāng)接種量過大時，發(fā)酵可利用的發(fā)酵劑變多，導(dǎo)致發(fā)酵時間縮短，使得發(fā)酵不完全導(dǎo)致含量減少，因此選擇富集γ-氨基丁酸的最佳接種量為5%，這與張園林等[15]報道的發(fā)酵后青稞中γ-氨基丁酸含量隨著菌種添加量的升高先增加后減少的變化一致。

圖2 接種量對β-葡聚糖(a)、γ-氨基丁酸(b)得率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of β-glucan (a)and γ-aminobutyric acid (b)

2.1.3 發(fā)酵時間對青稞中活性物質(zhì)的影響

藏靈菇發(fā)酵青稞富集β-葡聚糖的最佳發(fā)酵時間為36 h。由圖3a 可以看出，藏靈菇發(fā)酵青稞的過程中，β-葡聚糖的得率隨著發(fā)酵時間的增加呈先升高后降低的趨勢，得率在36 h 時達(dá)到最大值43.45%，相對于最低發(fā)酵時間，提高了1.29 倍，差異顯著（p＜0.05）。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期，β-葡聚糖酶活性較小，降解速率較慢，隨著時間增加，酶活性增強(qiáng)，使得β-葡聚糖降解加快，因此選擇富集β-葡聚糖的最佳發(fā)酵時間為36 h，這與劉新琦等[12]的研究結(jié)果相一致，發(fā)酵后的青稞中β-葡聚糖得率隨著發(fā)酵時間的延長先增加后減少。藏靈菇發(fā)酵青稞富集γ-氨基丁酸的最佳發(fā)酵時間為8 h。由圖3b 可以看出，藏靈菇發(fā)酵青稞的過程中，γ-氨基丁酸的得率隨著發(fā)酵時間的增加呈先升高后降低的趨勢，γ-氨基丁酸的得率在8 h時達(dá)到最大值60.74%，相對于最低發(fā)酵時間，提高了1.64 倍，差異顯著（p＜0.05）。這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵初期，蛋白酶沒有充分激活，隨著時間延長，蛋白質(zhì)水解形成了谷氨酸，在谷氨酸脫羧酶的作用下使得谷氨酸轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸[15]，后期γ-氨基丁酸富集，促進(jìn)γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的活性增強(qiáng)，使γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛酸，導(dǎo)致含量下降，因此選擇富集γ-氨基丁酸的最佳發(fā)酵時間為8 h。

圖3 發(fā)酵時間對β-葡聚糖(a)、γ-氨基丁酸(b)得率的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the yield of β-glucan (a) and γ-aminobutyric acid (b)

2.1.4 發(fā)酵溫度對青稞中活性物質(zhì)的影響

藏靈菇發(fā)酵青稞富集β-葡聚糖的最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。由圖4a 可以看出，β-葡聚糖的得率隨著發(fā)酵時間的增加呈先升高后降低的趨勢，得率在37 ℃時達(dá)到最大值45.01%，相對于最低發(fā)酵溫度25 ℃，提高了1.96 倍，差異顯著（p＜0.05）。這可能是因?yàn)樵?7 ℃時新陳代謝所需的酶活性達(dá)到較高水平[16]，因此選擇富集β-葡聚糖的最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。藏靈菇發(fā)酵青稞富集γ-氨基丁酸的最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。由圖4b可以看出，γ-氨基丁酸的得率隨著發(fā)酵時間的增長呈先升高后降低的趨勢，得率在37 ℃時達(dá)到最大值51.98%，相對于最低發(fā)酵溫度25 ℃，提高了1.81 倍，差異顯著（p＜0.05）。這可能是因?yàn)闇囟冗^高或過低則會破壞部分谷氨酸脫羧酶的活性，導(dǎo)致γ-氨基丁酸的含量下降，因此選擇富集γ-氨基丁酸的最佳發(fā)酵溫度為37 ℃，這與馮志彬等[17]報道的發(fā)酵后青稞中γ-氨基丁酸得率的變化一致，均隨溫度的升高得率呈先增加后減少的趨勢。

圖4 發(fā)酵溫度對β-葡聚糖（a）、γ-氨基丁酸（b）得率的影響Fig.4 Influence of fermentation temperature on the yield of β-glucan (a) and γ-aminobutyric acid (b)

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1β-葡聚糖響應(yīng)面分析

2.2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化藏靈菇發(fā)酵青稞富集β-葡聚糖的條件，選擇發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）作為試驗(yàn)因素，以β-葡聚糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，如表3。

表3 β-葡聚糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of β-glucan response surface test

2.2.1.2 回歸模型擬合及方差分析

進(jìn)行回歸擬合，得到回歸模型方程為：R1=48.32+1.15A-0.64B+0.084C+0.38AB-0.96AC+0.83BC-7.06A2-6.75B2-10.49C2?；貧w方程模型項(xiàng)p＜0.000 1，失擬項(xiàng)p=0.054 1＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明建立的回歸方程擬合良好。影響因子A、B的p＜0.05，表明發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）對β-葡聚糖的得率的影響較顯著。二次回歸方程的決定系數(shù)R2為99.81%，說明99.81%的響應(yīng)值變化可以用該模型解釋。校正決定R2=99.56%，與R2相近，進(jìn)一步說明了模型的顯著性。所以可以利用此模型和方程確定藏靈菇發(fā)酵青稞富集β-葡聚糖的最佳富集工藝。比較各項(xiàng)p值可以看出各因素對響應(yīng)值的影響大小為A＞B＞C，即發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間。各因素之間存在交互作用，交互作用顯著性依次為AC＞BC＞AB。

2.2.1.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析

從圖5可以看出，AC 和BC 的響應(yīng)面比AB 的坡度更陡峭，AC 的響應(yīng)面比BC 的坡度更陡峭，說明發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量、發(fā)酵時間的交互作用對β-葡聚糖得率的影響極顯著，而發(fā)酵溫度、接種量的交互作用不顯著。

圖5 β-葡聚糖的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot of β-glucan

從圖5的響應(yīng)面圖可以看出，發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間對發(fā)酵青稞中β-葡聚糖得率的影響均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且β-葡聚糖的得率在三因素所設(shè)定的水平范圍內(nèi)均存在最高值。從等高線圖中可以看出交互作用AC、BC 等高線比起交互作用AB 等高線更為密集，說明影響的顯著性順序?yàn)锳C＞BC＞AB，這與方差分析的結(jié)果一致。

2.2.2γ-氨基丁酸響應(yīng)面分析

2.2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化藏靈菇發(fā)酵青稞富集γ-氨基丁酸的條件，選擇發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）作為試驗(yàn)因素，以γ-氨基丁酸得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，如表4。

表4 γ-氨基丁酸響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of γ-aminobutyric acid response surface test

2.2.2.2 回歸模型擬合及方差分析

進(jìn)行回歸擬合，得到回歸模型方程為：R1=+54.50+0.66A+0.66B+0.93C+0.11AB+1.27AC-1.58BC-4.47A2-5.13B2-5.31C2?；貧w方程模型項(xiàng)p＜0.000 1，失擬項(xiàng)p=0.274 3＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明建立的回歸方程擬合良好。影響因子A、B、C的p值均小于0.05，表明發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）對γ-氨基丁酸的得率的影響較顯著。二次回歸方程的決定系數(shù)R2為98.68%，說明98.68%的響應(yīng)值變化可以用該模型解釋。校正決定系R2=98.98%，與R2相近，進(jìn)一步說明了模型的顯著性。所以可以利用此模型和方程確定藏靈菇發(fā)酵青稞富集γ-氨基丁酸的最佳富集工藝。比較各項(xiàng)p值可以看出各因素對響應(yīng)值的影響大小為C＞A＞B，即發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞接種量。各因素之間存在交互作用，交互作用顯著性依次為BC＞AC＞AB。

2.2.2.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析

從圖6可以看出，BC和AC的響應(yīng)面比AB的坡度更陡峭，BC的響應(yīng)面比AC的坡度更陡峭，說明接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間的交互作用對γ-氨基丁酸得率的影響極顯著。

從圖6的響應(yīng)面圖可以看出，因素發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間對發(fā)酵青稞中γ-氨基丁酸得率的影響均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且γ-氨基丁酸的得率在三因素所設(shè)定的水平范圍內(nèi)均存在最高值。從等高線圖中可以看出交互作用AC、BC等高線比起交互作用AB等高線更為密集，說明影響的顯著性順序?yàn)锽C＞AC＞AB，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖6 γ-氨基丁酸的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plot of γ-aminobutyric acid

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1β-葡聚糖驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對回歸方程進(jìn)行分析，得到最佳工藝條件為：菌種添加量為5%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為36 h。此條件下得出的β-葡聚糖的得率的理論值為48.18%。為證實(shí)結(jié)果是否正確，進(jìn)行3 組重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)得到的β-葡聚糖的得率為48.26%，試驗(yàn)值與預(yù)測值吻合，說明建立的模型可靠。國內(nèi)外對于青稞中β-葡聚糖的富集已有許多方法，如超聲波提取法、酶制劑法、多菌種發(fā)酵法、發(fā)芽法等。羅燕平等[18]通過微波輔助法，得到的β-葡聚糖的得率為5.92%；王謙等[19]采用超高壓提取方法從青稞中提取β-葡聚糖，β-葡聚糖得率為3.72%；而本實(shí)驗(yàn)中，通過藏靈菇發(fā)酵，青稞中的β-葡聚糖得率為48.26%，較以上方法，本實(shí)驗(yàn)青稞中β-葡聚糖得率分別提高了8.15 倍（p＜0.05）、12.97倍（p＜0.05）。

2.3.2γ-氨基丁酸驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對回歸方程進(jìn)行分析，得到最佳工藝條件為：菌種添加量為5%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為8 h。此條件下得出的γ-氨基丁酸的得率的理論值為54.46%。為證實(shí)結(jié)果是否正確，進(jìn)行3 組重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)得到的γ-氨基丁酸的得率為54.51%，試驗(yàn)值與預(yù)測值吻合，說明建立的模型可靠。張圓林等[20]以紅曲霉CH-1 發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸，得到的γ-氨基丁酸含量為17.19%；研究發(fā)現(xiàn)[21-23]選擇浸泡發(fā)芽工藝富集γ-氨基丁酸，其含量達(dá)10.33%；本實(shí)驗(yàn)中，通過藏靈菇發(fā)酵，青稞中的γ-氨基丁酸得率為54.51%，與其他方法比較，分別提高了3.17 倍（p＜0.05）、5.28 倍（p＜0.05）。

3 結(jié)論

本研究以青藏高原特色作物青稞為原料，采用藏靈菇進(jìn)行液體發(fā)酵，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，以β-葡聚糖、γ-氨基丁酸的得率為測定指標(biāo)對青稞中富集β-葡聚糖和γ-氨基丁酸的工藝進(jìn)行研究。

通過單因素試驗(yàn)確定藏靈菇發(fā)酵富集青稞中β-葡聚糖的最佳條件為料液比1:25，藏靈菇接種量5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間36 h；富集青稞中γ-氨基丁酸的最佳條件為1:30，藏靈菇接種量5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間8 h。

通過響應(yīng)面試驗(yàn)得出發(fā)酵富集β-葡聚糖的最佳藏靈菇接種量為5%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時間為36 h；富集γ-氨基丁酸的最佳藏靈菇接種量為5%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時間為8 h，得到的β-葡聚糖的得率為48.17%，γ-氨基丁酸的得率為54.46%，通過驗(yàn)證試驗(yàn)得出β-葡聚糖的得率是48.26%，γ-氨基丁酸的得率是54.51%，β-葡聚糖得率較未發(fā)酵前提高了1.93 倍（p＜0.05），γ-氨基丁酸得率較未發(fā)酵前提高了1.8 倍（p＜0.05）。

結(jié)果表明，藏靈菇發(fā)酵能夠有效富集青稞中的營養(yǎng)物質(zhì)，為青稞中營養(yǎng)物質(zhì)的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為青稞的深加工利用提供參考。