宋超，管雪婷,2，袁巧云*，何洋,2*，張跡,2，胡衛(wèi)成

（1.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇淮安 223300）（2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

主產(chǎn)于西藏、云南、四川、甘肅等省的密生波羅花（Incarvillea compactaMaxim.），是我國(guó)特有植物，為紫葳科（Bignoniaceae）角蒿屬（Incarvillea A.Juss）多年生草本植物，生長(zhǎng)于海拔3 300～4 900 m 的草坡[1]，是常用藏藥，全草入藥。據(jù)《中華本草：藏藥卷》和《藏藥志》記載，密生波羅花具有清熱、解毒、燥濕、消食之功效[2,3]，主要用于治療肺炎、發(fā)熱、黃疸、中耳炎、高血壓、胃痛等病癥[4]，其中，以其抗炎作用最為引人注目。然而，目前關(guān)于密生波羅花藥理作用的機(jī)理和生物活性成分的研究仍僅有很少的文獻(xiàn)報(bào)道。吳海峰等[5]從密生波羅花根中分離了Z-3′′-異甲氧基圓齒列當(dāng)苷、3′-甲氧基圓齒列當(dāng)苷、圓齒列當(dāng)苷和異角胡麻苷等4 個(gè)苯乙醇苷類化合物。Zhao 等[6]分析了密生波羅花的化學(xué)組成，鑒定了23 種化合物，包括苯丙素苷類、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類、三萜類、類固醇等化合物。王明明等[7]從密生波羅花醇提物中分離鑒定了亞麻酸甲酯、苜蓿素、鼠李秦素等10 種化合物。近年來，郭佳佳等[8]從密生波羅花的不同萃取物中鑒定出25 種化合物，并初步證實(shí)了密生波羅花水提物具有顯著的抗氧化作用和鎮(zhèn)痛作用。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中也從密生波羅的根部分離了多種苯乙醇苷類化合物，證明其具有顯著的抗氧化活性和肝保護(hù)作用[9,10]。

神經(jīng)酰胺（Ceramides）作為一種鞘脂類物質(zhì)，是近年來新興的功能食品、藥品和化妝品中的活性成分，對(duì)皮膚角質(zhì)層形成、維持皮膚屏障、保濕、抗衰老等生理功能具有重要作用[11]。此外，神經(jīng)酰胺還具有調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣平衡等多種生理作用[12]。紀(jì)漫等[13]從龍眼核中分離了富含神經(jīng)酰胺的活性脂質(zhì)組分，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活性具有明顯的促進(jìn)作用。趙超等[14]采用反復(fù)硅膠柱色譜法等分離純化方法，并通過質(zhì)譜、核磁共振等波譜分析方法從黑骨藤中分離鑒定了2 個(gè)神經(jīng)酰胺類化合物。李海池等[15]則采用超臨界CO2萃取-分子蒸餾法提取了魔芋神經(jīng)酰胺。目前，從食用或藥用植物資源中分離神經(jīng)酰胺類物質(zhì)及生理活性應(yīng)用研究仍顯不足。此外，神經(jīng)酰胺在動(dòng)植物中的含量普遍較少，因此選取富含神經(jīng)酰胺的動(dòng)植物資源，開發(fā)功能食品、藥品和化妝品已成為神經(jīng)酰胺開發(fā)利用的研究熱點(diǎn)。

炎癥是動(dòng)物機(jī)體在受到損傷或感染后，在各種致炎因子作用下所發(fā)生的一系列由多種細(xì)胞、多種因子參與的復(fù)雜保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，通常在原發(fā)的具有血管系統(tǒng)的組織附近首先出現(xiàn)[16,17]。適度炎癥會(huì)通過激活免疫系統(tǒng)來清除病原體，并促進(jìn)受損傷組織的愈合，如吞噬搬運(yùn)壞死組織，消除致病因子等，但是過量的細(xì)胞因子、趨化因子等炎癥介質(zhì)會(huì)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，將進(jìn)一步加劇炎癥損傷[18]，從而增加包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病率和死亡率[19,20]。引起炎癥的因素很多，主要有細(xì)菌、病毒、支原體等病原微生物感染，菌體成分如存在于革蘭陰性細(xì)菌外膜的脂多糖毒素（LPS）等是細(xì)菌感染導(dǎo)致的急性炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵介質(zhì)，LPS 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可引起炎癥信號(hào)的級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)或瀑布反應(yīng)，刺激免疫細(xì)胞過量分泌腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）及白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等促炎細(xì)胞因子，可引起多個(gè)器官衰竭，甚至出現(xiàn)中毒性休克乃至患者死亡[21,22]。因此，抑制前炎癥分子的產(chǎn)生成為預(yù)防和治療各種疾病的重要靶點(diǎn)[23]。本研究通過構(gòu)建密生波羅花神經(jīng)酰胺類成分對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞體外細(xì)胞炎癥模型來探討密生波羅花神經(jīng)酰胺類成分的抗炎功效，為保護(hù)和合理開發(fā)利用我國(guó)這一民族藥用植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

密生波羅花：購于青海省西寧市藥材市場(chǎng)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所吳海峰研究員鑒定，樣品保存在淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院。四甲基乙二胺（TEMED），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；亞硝酸鈉、噻唑藍(lán)（MTT）、臺(tái)盼藍(lán)、脂多糖（LPS）、胎牛血清（FBS），美國(guó)Sigma 公司；1640 培養(yǎng)基、抗生素，美國(guó)Gibco 公司；蛋白質(zhì)Marker，美國(guó)NEB 公司；微量BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液、30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；過硫酸銨，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Trizol，美國(guó)Invitrogen 公司；抗體TNF-α、COS-2、iNOS、β-actin，美國(guó)Cell Signaling 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bruker Avance III 400 M 核磁共振波譜儀（氘代吡啶）、Ultimate 3000 型超高效液相色譜儀，美國(guó)Dionex公司；串聯(lián)Thermo Q Exactive Plus 型高分辨質(zhì)譜，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；化合物分析鑒定軟件，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；PCR 擴(kuò)增儀，ABI公司；電泳槽、Gel XP System 伯樂凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad 公司；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Tecan Infinite M200PRO 酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，日本SANYO 公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf 公司；KQ-500B 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 密生波羅花神經(jīng)酰胺的提取與分離

取2.0 kg 干燥的密生波羅花全草粉碎，在60 ℃條件下，用10 L 體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取10 h，重復(fù)提取3 次后合并提取液，減壓濃縮得提取物382.4 g。將350 g 提取物懸浮于3 L 純水中，用3 L 乙酸乙酯萃取，重復(fù)萃取3 次后合并萃取液，60 ℃減壓濃縮，得到乙酸乙酯萃取物86.6 g。取80.0 g 乙酸乙酯萃取物溶于300 mL 甲醇中，然后吸附于柱層析硅膠上（200 g，100～200 目），進(jìn)行硅膠柱層析（800 g，100～200 目）。先以石油醚-乙酸乙酯（V/V=1:1）的混合溶劑充分洗脫除去其中的中性化合物，然后以二氯甲烷-甲醇-三乙胺（V/V/V=80:20:1）的混合溶劑洗脫，通過薄層色譜（TLC）合并含有生物堿的洗脫液并減壓濃縮得密生波羅花神經(jīng)酰胺（762.3 mg）。

1.3.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters BEH Amide Column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫：45 ℃，進(jìn)樣體積：5 μL，流速：0.25 mL/min，流動(dòng)相：A（乙腈-水-10 mmol 乙酸銨-0.1%甲酸）；B（異丙醇-乙腈-10 mmol 乙酸銨-0.1%甲酸）。梯度洗脫：0～5 min，15% B～30% B；5～10 min，30%～50% B；10～15 min，50% B～54% B；15～20 min，54% B～70% B；20～35 min，70% B～99% B；35～45 min，99% B；45～50 min，99% B～15% B；50～60 min，15% B。

離子源：加熱電噴霧離子化源（HESI）；鞘氣流量40 arb，輔助氣體流量15 arb，毛細(xì)管溫度320 ℃，輔助氣體加熱器溫度350 ℃，正噴霧電壓3.2 kV，負(fù)噴霧電壓3.0 kV。MS 的分辨率為70 000，MS/MS 的分辨率為17 500，掃描方式為全掃模式，正離子模式檢測(cè)，質(zhì)譜掃描范圍m/z：100～1 500。未知化合物的鑒定采用Compound discover 3.2、mzcloud 和mzVault數(shù)據(jù)庫。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)在溫度為37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)基為含有鏈霉素（100 μg/mL）、青霉素（100 U/mL）及胎牛血清（10wt%）的RPMI 1640 培養(yǎng)基，24～48 h 更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.3.4 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖活性的影響

MTT 工作液配制：取1 g 噻唑藍(lán)試劑溶于200 mL PBS 中，避光條件下用0.22 μm 濾膜過濾除菌，放4 ℃冰箱保存，保存容器需包裹錫箔紙用以避光[24]。MTT終止液配制：稱取5.00 g SDS 試劑溶于0.01 mol/L HCl溶液并定容至50 mL。

用細(xì)胞刮刮取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞加入RPMI 1640 培養(yǎng)基中，將細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升1×106個(gè)后接種于96 孔培養(yǎng)板（每孔100 μL），培養(yǎng)16 h。向培養(yǎng)板中加入不同濃度密生波羅花神經(jīng)酰胺，每個(gè)濃度梯度重復(fù)3 次，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液并加入MTT 工作液（每孔100 μL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入MTT 終止液（每孔100 μL），用酶標(biāo)儀測(cè)其550 nm 處A 值。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置空白組和樣本處理組。

式中：

C——相對(duì)細(xì)胞存活率，%；

A0——空白組孔A 值；

A1——樣本處理組孔A 值；

A2——實(shí)驗(yàn)組孔A 值。

1.3.5 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì) LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 的影響

取細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7 細(xì)胞，接種于96 孔培養(yǎng)板（每孔100 μL），培養(yǎng)16 h。加入50 μL 的LPS（最終質(zhì)量濃度1 μg/mL）刺激30 min 后，加入不同濃度密生波羅花神經(jīng)酰胺，實(shí)驗(yàn)設(shè)置LPS 組、實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，每組重復(fù)3次。用Griess 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO 含量[25]。

1.3.6 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì) LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞，并用RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升5×106個(gè)。取5×106個(gè)RAW264.7 細(xì)胞，接種于4 mL 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16 h 后加入LPS（1 μg/mL）刺激30 min，再分別加入質(zhì)量濃度50 μg/mL、100 μg/mL 的密生波羅花神經(jīng)酰胺處理細(xì)胞6 h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組，LPS 組和實(shí)驗(yàn)組。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，取2 μL RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于PCR 擴(kuò)增。半定量PCR 檢測(cè)IL-1β、TNF-α及iNOS等炎癥因子mRNA 的表達(dá)量，PCR 反應(yīng)體系為：10 μL 2×Taq MasterMix、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、無菌超純水6 μL。GAPDH、IL-1β、TNF-α及iNOS 的PCR 擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃、2 min，變性94 ℃、30 s，退火（GAPDH、56 ℃，COX-2、60 ℃，TNF-α、55 ℃）、30 s，延伸72 ℃、40 s，PCR 擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃、5 min。PCR 擴(kuò)增所用引物由上海生工合成，具體序列見表1。

表1 本文所用相關(guān)引物Table 1 Primers used in this work

1.3.7 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì) LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞IκBα、PDK1 及AKT 蛋白表達(dá)和活化的影響

在4 mL培養(yǎng)皿中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7 細(xì)胞5×106個(gè)，培養(yǎng)16 h。加入LPS（終濃度1 μg/mL）刺激30 min 后，分別加入質(zhì)量濃度為50、100 μg/mL 的密生波羅花神經(jīng)酰胺處理6 h。吸除培養(yǎng)基并用PBS 沖洗細(xì)胞，離心15 min 后（4 ℃、14 000 r/min），加入200 μL 蛋白酶裂解液及一勺玻璃珠充分振蕩后再離心10 min（4 ℃、14 000 r/min），上清液即為細(xì)胞總蛋白。運(yùn)用BCA 試劑盒法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定細(xì)胞總蛋白的濃度，通過Western Blot 檢測(cè)p-IκBα/IκBα、p-PDK1/PDK1及p-AKT/AKT 蛋白表達(dá)。將樣品蛋白在94 ℃溫度下變性5 min 后，SDS-PAGE 電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜。將蛋白轉(zhuǎn)膜移至封閉液中，室溫?fù)u床脫色，分別加入一抗、二抗并室溫孵育洗滌，加入顯色劑采集圖像。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，LPS 組和藥物處理組。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔，結(jié)果以Mean±SD表示，數(shù)據(jù)分析在SPASS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件中完成，Sigma Plot 繪圖，電泳條帶的灰度值采用Image J 軟件檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 密生波羅花神經(jīng)酰胺的定量和定性

神經(jīng)酰胺類生物堿一般含有一個(gè)氮原子，在正離子模式下易形成[M+H]+，m/z值顯示為偶數(shù)。圖1為密生波羅花神經(jīng)酰胺在正離子模式下超高效液相-高分辨質(zhì)譜總離子流圖，依據(jù)compound discover 3.2 軟件及mzcloud 和mzVault 數(shù)據(jù)庫從中鑒定了138 個(gè)化合物，其中113 個(gè)化合物為神經(jīng)酰胺類成分，根據(jù)面積歸一化法，這113 個(gè)化合物的峰面積總和占全部138 個(gè)化合物峰面積總和的81.53%。從表2可看出密生波羅花神經(jīng)酰胺中非生物堿成分主要為濱蒿內(nèi)酯、verrucarol、烏蘇酸和皮諾斂酸，明確化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物堿有α-linolenoyl ethanolamide 和mexedrone，但含量最高的為各種神經(jīng)酰胺（Cer）和己糖基神經(jīng)酰胺（Hexcer）。

表2 密生波羅花神經(jīng)酰胺中代表性成分結(jié)構(gòu)信息Table 2 Structural information of some representative compounds in the total ceramides from I.compacta

圖1 密生波羅花神經(jīng)酰胺在正離子模式下超高效液相-高分辨質(zhì)譜總離子流圖Fig.1 UPLC-HR-MS spectrum of the total ceramides from I.compacta in positive ion mode

神經(jīng)酰胺類化合物的主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是其含有的2條長(zhǎng)脂肪鏈通過酰胺鍵相連接，脂肪鏈大部分以飽和碳原子的形式存在，存在少數(shù)雙鍵，少數(shù)飽和碳原子連接羥基或通過醚鍵成環(huán)。圖2為密生波羅花神經(jīng)酰胺的核磁共振氫譜圖，對(duì)比同屬植物兩頭毛中神經(jīng)酰胺的核磁數(shù)據(jù)[26]，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)植物中神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)極為類似。δ5.36～5.73 為雙鍵上的烯氫信號(hào)，δ3.70～4.92為連氧次甲基信號(hào)，δ1.24～2.37 為脂肪鏈中的亞甲基信號(hào)，δ0.86 為脂肪鏈的末端甲基信號(hào)。由于測(cè)試樣品為一組混合物，結(jié)構(gòu)差異較小，核磁信號(hào)重疊嚴(yán)重，導(dǎo)致各組信號(hào)的裂分不是很明顯。

圖2 密生波羅花神經(jīng)酰胺的核磁共振氫譜Fig.2 1H-NMR spectrum of the total ceramides from I.compacta

圖3為密生波羅花神經(jīng)酰胺的核磁共振碳譜圖，與兩頭毛中神經(jīng)酰胺的核磁數(shù)據(jù)對(duì)比[26]，δ14.1 為末端甲基碳信號(hào)，δ22.7 為末端甲基旁邊的亞甲基碳信號(hào)，δ29.2～29.8 為脂肪鏈中間系列亞甲基碳信號(hào)，δ31.9～37.0 為雙鍵、酰胺鍵或連氧碳原子旁邊的亞甲基碳信號(hào)，δ55.0～79.0 為各種連氧次甲基碳信號(hào)，δ128.0～130.7 為雙鍵碳信號(hào)，δ173.0～175.5 為酰胺鍵碳信號(hào)。

圖3 密生波羅花神經(jīng)酰胺的核磁共振碳譜Fig.3 13C-NMR spectrum of the total ceramides from I.compacta

綜合UPLC-HR-MS/MS、核磁共振氫譜和核磁共振碳譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻(xiàn)[26]報(bào)道的數(shù)據(jù)，確定密生波羅花提取物中的主要成分為神經(jīng)酰胺類化合物。

2.2 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖活性的影響

如圖4所示，與正常對(duì)照組相比LPS 對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，可排除實(shí)驗(yàn)中LPS 的影響。濃度為6.25～50 μg/mL的密生波羅花神經(jīng)酰胺可促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞增值，且細(xì)胞相對(duì)存活率分別為105.16%、110.86%、111.36%、107.53%。當(dāng)濃度達(dá)100 μg/mL 時(shí)，密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)RAW264.7 細(xì)胞有毒性作用（p＜0.01），降低了RAW264.7 細(xì)胞的增殖活性，細(xì)胞相對(duì)存活率為88.12%。有學(xué)者研究顯示，乙酰氨基酚[27]、吲哚美辛[28]等常用抗炎藥物的有效成分都具有不同程度的細(xì)胞毒性，對(duì)細(xì)胞的增殖活性具有負(fù)影響，甚至有研究指出，臨床常用的抗炎藥物布洛芬可致患者出現(xiàn)中毒性表皮壞死松解癥[29]，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。與上述抗炎藥物相比，密生波羅花神經(jīng)酰胺具有毒副作用小，安全性高的特點(diǎn)。

圖4 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖活性的影響Fig.4 Effects of the total ceramides from I.compacta on RAW264.7 cell proliferative viability

2.3 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO 的影響

NO 作為毒性很強(qiáng)的氣體自由基，過量會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，促使細(xì)胞變性、組織黏連，產(chǎn)生組織損傷，加劇炎癥反應(yīng)[30]，且iNOS 是NO 合成所必需的限速酶，iNOS 的表達(dá)量與NO 合成量呈正相關(guān)。因此，抑制NO的釋放或iNOS表達(dá)可能成為治療炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)[31]。本研究運(yùn)用Griess 法檢測(cè)細(xì)胞釋放的NO量，得到的NO 反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.007 4x+0.002 6（R2=0.999 8）。其中，x為樣品濃度，y為A 值。

如圖5所示，LPS 可刺激RAW264.7 細(xì)胞釋放遠(yuǎn)高于正常狀態(tài)下的NO，且對(duì)照組比較差異性顯著（p＜0.05）。加入密生波羅花神經(jīng)酰胺后，RAW264.7細(xì)胞NO 釋放量明顯降低（p＜0.01），且NO 釋放量與加入的密生波羅花神經(jīng)酰胺濃度呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系，加入6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 的密生波羅花神經(jīng)酰胺后，RAW264.7 細(xì)胞NO 釋放量分別為45.13、38.85、28.79、12.27、4.61 μmol/L，抑制率分別為12.53%、24.71%、44.19%、76.23%、91.07%。因此，LPS 能誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO，而密生波羅花神經(jīng)酰胺能夠不同程度抑制LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌NO 呈濃度依賴性。

圖5 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 的影響Fig.5 Effects of the total ceramides from I.compacta on RAW264.7 production of NO

有學(xué)者研究表明，濃度為0.625 mg/mL 的常用抗炎藥物安兒寧顆粒，對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO的抑制率為43.64%[32]，100 μg/mL 的柴桂口服液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 的抑制率為70.85%[33]，低于本研究中相近濃度密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 的抑制率。

2.4 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄IL-1β、TNF-α 及iNOS mRNA 的影響

細(xì)菌脂多糖（LPS）為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜主要成分，也是重要的致炎因子，可誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞表達(dá)、釋放多種炎癥介質(zhì)[21,34]，如TNF-α、IL-1β、iNOS 及NO 等，從而引發(fā)和加重炎癥并產(chǎn)生組織損傷[35]。其中TNF-α是炎癥反應(yīng)初期最早產(chǎn)生的重要炎癥介質(zhì)，可刺激其他致炎因子的表達(dá)、釋放[36]，并促使炎癥介質(zhì)聚集[37]，誘發(fā)并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。IL-1β是炎癥反應(yīng)中的重要介質(zhì)，且在組織損傷后會(huì)在濃度升高，能夠維持、促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致疼痛產(chǎn)生[38]。

如圖6所示，由半定量PCR 結(jié)果可知，LPS 可促使RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)IL-1β、TNF-α及iNOS 相關(guān)炎癥因子的mRNA 表達(dá)水平顯著升高。密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)IL-1β、TNF-α及iNOS 的mRNA 表達(dá)均有一定的抑制作用，電泳條帶灰度值分析結(jié)果顯示，密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)IL-1β和TNF-αmRNA 表達(dá)的抑制作用更為明顯，且濃度越高，抑制效果越好。

圖6 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞IL-1β、TNF-α 及iNOS mRNA 表達(dá)的影響Fig.6 Effects of the total ceramides from I.compacta on IL-1β and TNF-α and iNOS mRNA expression in RAW264.7 cells in response to LPS stimulation

2.5 不同濃度密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞IκBα、PDK1 及AKT 蛋白表達(dá)及活化的影響

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑[39]，在多種慢性疾病中發(fā)揮促炎作用[40,41]。IκBα、PDK1 及AKT 蛋白是PI3K/AKT 信號(hào)通路傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵媒介底物，在靜息狀態(tài)下，通常以失活的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)有信號(hào)激活后，IκBα、PDK1及AKT 蛋白會(huì)磷酸化，產(chǎn)生p-IκBα、p-PDK1 及p-AKT蛋白，從失活狀態(tài)活化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合，啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥[42]。Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，正常情況下，RAW264.7 細(xì)胞中IκBα、PDK1 及AKT 蛋白均有所表達(dá)，但p-IκBα、p-PDK1 及p-AKT 蛋白表達(dá)水平相對(duì)較低，即IκBα、PDK1 及AKT 蛋白活化程度較弱。在LPS 刺激下，p-IκBα、p-PDK1 及p-AKT 蛋白含量明顯提升，即IκBα、PDK1 及AKT 蛋白活化程度提高。

密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)IκBα、PDK1 及AKT 蛋白的表達(dá)有抑制作用，且對(duì)其活性亦有抑制作用，且密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)PDK1 及AKT 蛋白表達(dá)的抑制作用具有濃度依賴性（如圖7所示）。該結(jié)果表明在LPS刺激下，即IκBα、PDK1 及AKT 蛋白活化程度提高，但在密生波羅花神經(jīng)酰胺干預(yù)后，其可通過抑制IκBα、PDK1 及AKT 蛋白的表達(dá)及活化來調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而控制炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，減輕炎癥反應(yīng)[43]。

圖7 密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞IκBα、PDK1 及AKT 蛋白表達(dá)及活化程度的影響Fig.7 Effects of the total ceramides from I.compacta on IκBα and PDK1 and AKT expression and activation in RAW264.7 cells in response to LPS stimulation

3 結(jié)論

本文從紫葳科角蒿屬植物密生波羅花中提取了神經(jīng)酰胺類成分，并對(duì)其體外抗炎活性進(jìn)行了初步的研究。結(jié)果顯示，低濃度的密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞增殖活性具有促進(jìn)作用，且密生波羅花神經(jīng)酰胺干預(yù)可通過抑制iNOS mRNA 和蛋白表達(dá)，從而有效控制NO 的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)和組織損傷。在密生波羅花神經(jīng)酰胺干預(yù)后，LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá)量明顯降低，且呈劑量依賴性遞減，表明密生波羅花神經(jīng)酰胺對(duì)IL-6和IL-1β的表達(dá)具有抑制作用，有利于炎癥的治療和炎癥引起的組織損傷恢復(fù)。密生波羅花神經(jīng)酰胺干預(yù)還可抑制IκBα、PDK1 及AKT 蛋白的表達(dá)及活化，從而控制炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，減輕炎癥反應(yīng)。綜上所述，密生波羅花神經(jīng)酰胺可以通過抑制IκBα、PDK1 及AKT 蛋白的表達(dá)及其活化，減少IL-1β、TNF-α及iNOS相關(guān)炎癥因子mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)和NO 產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)的過程。