李新宇，謝晨陽，黃秋萍，金斌，董哲文，鐘萍，宋家樂,3*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541101）（2.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科，廣西桂林 541109）（3.廣西衛(wèi)生健康委員會(huì)全生命周期健康保健研究實(shí)驗(yàn)室，廣西環(huán)境暴露組學(xué)與全生命周期健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541101）

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovarian Syndrome，PCOS）是一種育齡期女性常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要臨床癥狀有高雄激素血癥、多囊性卵巢、排卵障礙及卵巢纖維化等[1]。除生殖障礙與激素失衡外，PCOS 患者常伴有肥胖、胰島素抵抗、血脂紊亂等代謝疾病[2]。目前，臨床上常用胰島素增敏劑對(duì)PCOS 進(jìn)行治療，但長(zhǎng)期或過高劑量的使用會(huì)引起頭痛、胃腸道不適等不良反應(yīng)[3]。因此，尋找能有效治療且副作用較小的方案是目前PCOS 疾病研究方向上的熱點(diǎn)問題之一。

腸道菌群是正常定植于人體腸道的一類微生物的總稱，可通過與宿主細(xì)胞的相互作用以及對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)化在不同程度上影響人體健康[4]。研究表明，腸道菌群失調(diào)與PCOS 之間存在密切聯(lián)系[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 患者的腸道菌群失調(diào)主要表現(xiàn)為α多樣性下降，擬桿菌屬增加和疣微菌門減少[6]。動(dòng)物研究中也提示來曲唑誘導(dǎo)的PCOS 小鼠體內(nèi)腸道菌群物種的多樣性和豐富度明顯減少[7]。此外，腸道菌群的紊亂將導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，使機(jī)體免疫系統(tǒng)異常激活，并由此干擾胰島素受體功能和性激素分泌，影響卵巢發(fā)育[8]。

益生菌作為腸道菌群的主要構(gòu)成部分，是一類對(duì)宿主健康有益的活性微生物，其可以調(diào)節(jié)宿主腸道菌群比例，改善異常的性激素水平和糖脂代謝紊亂[9,10]。目前的研究提示，益生菌能夠作為輔助手段來改善PCOS 的臨床癥狀。連續(xù)服用12 周的益生菌補(bǔ)充劑（含嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和雙歧桿菌）可以有效調(diào)節(jié)PCOS 患者體內(nèi)激素和炎癥指標(biāo)的水平[11]。而Meta 分析也提示益生菌補(bǔ)充劑（含嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌等）可有效控制PCOS 患者的體質(zhì)量和體質(zhì)指數(shù)（Body Mass Index，BMI），并降低血糖、胰島素（Insulin，INS）、甘油三酯（Triglyceride，TG）和睪酮（Testosterone，T）水平[12]。來曲唑作為一種芳香化酶抑制劑，可通過抑制雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致高雄激素血癥，引發(fā)類似PCOS 的癥狀[13]。因此，本研究以來曲唑誘導(dǎo)的PCOS 大鼠為模型，觀察乳雙歧桿菌、丁酸梭菌、植物乳桿菌三種益生菌對(duì)PCOS大鼠臨床癥狀的改善作用并探討作用機(jī)制，為益生菌應(yīng)用于PCOS 的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

來曲唑（L833525，純度大于98%），上海麥克林生化科技有限公司；植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum，SG1），本課題組自行分離保存菌株；乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis，HH-BA68），鄭州和合生物工程技術(shù)有限公司；丁酸梭菌（Clostridium butyricum，GIM1.262），廣東省微生物研究所菌種保藏中心；雌二醇（Estradiol，E2，MM-0575R1）、T（MM-0577R1）、黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH，MM-0624R1）、卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH，MM-70867R1）和INS（MM-0587R1）水平測(cè)定用ELISA 試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；總膽固醇（Total Cholesterol，TC，A111-1-1）、TG（A110-1-1）、低密度脂蛋白（Low-Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C，A113-1-1）、高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C，A112-1-1）、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，H255）試劑盒，南京建成生物工程研究所；Masson 三色染色試劑盒（BP-DL021），南京森貝伽生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度試劑盒（P0012）、5X SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（P0286-15 mL）、Smad4（AF1291）、Smad3（AF1501）、Phospho-Smad3（p-Smad3，AF1759）、Smad2（AF1300）、Phospho-Smad2（p-Smad2，AF2545）、GAPDH（AF1186）抗體，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf 5424R 型冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo Scientific 科技公司；Leica DM4B 正置顯微鏡，德國Leica 儀器有限公司；FluorChem M 超靈敏全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，美國ProteinSimple 公司；KZ-II高速組織研磨儀，武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD 大鼠（共35 只，6 周齡，體質(zhì)量160～190 g），購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)單位許可證號(hào)：SYXK（桂）2020-0005。所有大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境內(nèi)合籠飼養(yǎng)（每籠2～3 只），室溫（22±1）℃，相對(duì)濕度60%，保持明暗周期（12 h/12 h）一致，自由攝食及清潔飲水。本研究經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過（GLMC201806003）。

1.4 益生菌培養(yǎng)及菌液制備

乳雙歧桿菌和植物乳桿菌菌液依照李娜等[14]的方法，丁酸梭菌菌液依照亓秀曄等[15]的方法進(jìn)行制備。將乳雙歧桿菌、植物乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，丁酸梭菌接種于丁酸梭菌增殖培養(yǎng)基中，在厭氧環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行菌體計(jì)數(shù)。根據(jù)測(cè)定的活菌數(shù)將一定量的乳雙歧桿菌、植物乳桿菌及丁酸梭菌重懸于生理鹽水中各配置成濃度為1×109CFU/mL 的菌液[16]。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案

PCOS 大鼠模型建立參考He 等[17]的方法?？?5只雌性大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成正常組、PCOS 組、PCOS+乳雙歧桿菌組、PCOS+丁酸梭菌組、PCOS+植物乳桿菌組，每組7 只。正常組給予1wt%羧甲基纖維素鈉（Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC）灌胃（1 mL/d），其余各組大鼠均給予來曲唑（每天1 mg/kg）-1wt% CMC 混懸液灌胃。同時(shí)，乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組、植物乳桿菌組分別灌胃等量的相應(yīng)活菌懸液（1 mL/d）。灌胃共持續(xù)28 d，其中乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組、植物乳桿菌組每只大鼠益生菌灌胃總量為28×109CFU。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，所有大鼠均自由攝食及飲水，并每3 天進(jìn)行體質(zhì)量監(jiān)測(cè)。

1.5.2 大鼠動(dòng)情周期檢測(cè)

從實(shí)驗(yàn)干預(yù)的第10 天開始，對(duì)所有大鼠進(jìn)行10 d的陰道涂片，以觀察其動(dòng)情周期規(guī)律。陰道涂片及巴氏染色法參考Cora 等的方法[18]。發(fā)情階段的判斷依據(jù)如下：動(dòng)情前期以扁平上皮細(xì)胞為主；動(dòng)情期以角質(zhì)化細(xì)胞為主；動(dòng)情期后期白細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、扁平上皮細(xì)胞3 種細(xì)胞比例相當(dāng)；動(dòng)情間期以白細(xì)胞為主。

1.5.3 血液及臟器的取材

干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水12 h。期間測(cè)量大鼠的體質(zhì)量，以鼻尖至肛門的長(zhǎng)度為體長(zhǎng)，按公式（1）計(jì)算肥胖指標(biāo)Lee’s 指數(shù)（記為E）[19]；取尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖（Fasting Plasma Glucose，F(xiàn)PG）。CO2麻醉處死大鼠后，腹主動(dòng)脈取血，待血液凝固后迅速離心分離出血清，-80 ℃低溫保存。大鼠置于冰上開腹，快速分離兩側(cè)卵巢以及內(nèi)臟脂肪（包括腎周脂肪、腹部脂肪和子宮周脂肪），并對(duì)內(nèi)臟脂肪進(jìn)行稱重。取一側(cè)卵巢快速置于m=4%多聚甲醛固定，其余-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

注：

m——大鼠體質(zhì)量，g；

l——大鼠體長(zhǎng)，cm。

1.5.4 卵巢組織病理學(xué)觀察

將固定后的卵巢組織浸入石蠟包埋，連續(xù)切取4 μm 的石蠟切片進(jìn)行Masson 染色，于顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織纖維化改變，其中細(xì)胞核、膠原纖維染色結(jié)果呈藍(lán)色，胞漿、肌肉染色結(jié)果呈紅色。另連續(xù)切取4 μm 的石蠟切片進(jìn)行H&E 染色，于顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織病理改變，統(tǒng)計(jì)每張切片的囊性卵泡數(shù)、黃體數(shù)并拍照記錄。

1.5.5 血清生化指標(biāo)的檢測(cè)

依照ELISA 試劑盒說明書要求檢測(cè)大鼠血清中E2、T、LH、FSH 以及空腹胰島素（Fasting Insulin，F(xiàn)INS）水平，并按公式（2）計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance，HOMA-IR）。

式中：

P——胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR；

F1——空腹血糖FPG，mmol/L；

F2——空腹胰島素水平FINS，mU/L。

1.5.6 血脂相關(guān)指標(biāo)及血清LPS 水平的檢測(cè)

依照ELISA 試劑盒說明書要求檢測(cè)大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C 及LPS 水平。

1.5.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)卵巢組織中TGF-β/Smads 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

稱取約30 mg 的卵巢組織，生理鹽水清洗血污，按10:1 的比例加入蛋白質(zhì)裂解液（含PMSF）提取卵巢總蛋白，于4 ℃，12 000 r/min 條件下離心10 min。收集上清液，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠（SDS-PAGE），加樣進(jìn)行電泳分離，待電泳完成后采用濕法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜1 h 后，將NC 膜放入10wt%脫脂奶粉中封閉2 h，一抗孵育過夜。次日采用相應(yīng)二抗孵育1 h 后，加入特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）顯示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 法，非正態(tài)分布資料采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同益生菌干預(yù)對(duì)PCOS 大鼠動(dòng)情周期的影響

如圖1所示，正常組大鼠始終保持規(guī)律的動(dòng)情周期，而PCOS 組大鼠的動(dòng)情周期呈不規(guī)律變化。經(jīng)乳雙歧桿菌、丁酸梭菌和植物乳桿菌干預(yù)后，三組大鼠的動(dòng)情周期逐漸恢復(fù)。上述結(jié)果提示，乳雙歧桿菌、丁酸梭菌、植物乳桿菌均能糾正PCOS 大鼠不規(guī)律的動(dòng)情周期，且植物乳桿菌的干預(yù)效果較好。

圖1 大鼠動(dòng)情周期中各階段的陰道涂片（a）及不同益生菌干預(yù)對(duì)大鼠發(fā)情周期的影響（b）Fig.1 Vaginal smears at each stage of the rat estrus cycle (a) and the effect of different probiotics intervention on the rat estrus cycle (b)

2.2 不同益生菌干預(yù)對(duì)PCOS 大鼠體質(zhì)量及Lee`s 指數(shù)的影響

如表1所示，造模前各組大鼠體質(zhì)量之間無顯著性差異（p＞0.05）。干預(yù)結(jié)束后，PCOS 組大鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量和Lee`s 指數(shù)均顯著上升，與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。與PCOS 組相比，乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組和植物乳桿菌組大鼠體質(zhì)量顯著下降7.91%、9.08%、9.91%（p＜0.05）；Lee`s 指數(shù)顯著降低3.33%、2.81%、4.55%（p＜0.05），內(nèi)臟脂肪顯著下降34.04%、23.76%、33.79%（p＜0.05），各干預(yù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。以上結(jié)果提示，乳雙歧桿菌、丁酸梭菌、植物乳桿菌可有效降低PCOS大鼠體質(zhì)量，改善其肥胖程度。石劉婷等[20]對(duì)3 株植物乳桿菌進(jìn)行豆乳發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LP5 的發(fā)酵豆乳能有效降低PCOS 大鼠的體質(zhì)量，所得結(jié)論與本研究類似。

表1 不同益生菌干預(yù)對(duì)PCOS 大鼠體質(zhì)量、Lee’s 指數(shù)以及內(nèi)臟脂肪質(zhì)量的影響Table 1 Effects of different probiotics intervention on body mass,Lee’s index and visceral fat mass in PCOS rats

2.3 不同益生菌干預(yù)對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織學(xué)改變的影響

由圖2a 所示，正常組大鼠卵巢表面較紅潤，而PCOS 組大鼠卵巢表面較蒼白，體積明顯增大。乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組、植物乳桿菌組大鼠經(jīng)干預(yù)后卵巢表面相比PCOS 組色澤偏紅，體積減小。H&E 染色結(jié)果顯示（圖2b），與正常組相比，PCOS 組大鼠卵巢囊性卵泡數(shù)量增多，黃體數(shù)量明顯減少。如表2所示，與PCOS 組相比，植物乳桿菌組大鼠卵巢黃體數(shù)量明顯增多，且囊性擴(kuò)張卵泡數(shù)量顯著減少（p＜0.05），而乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組大鼠卵巢黃體數(shù)量并未有顯著增加，但囊性卵泡數(shù)量明顯減少（p＜0.05）。以上結(jié)果表明，乳雙歧桿菌、丁酸梭菌、植物乳桿菌均能有效改善PCOS 大鼠的卵巢組織損傷。

圖2 不同益生菌干預(yù)對(duì)各組大鼠卵巢形態(tài)（a）及其組織變化（b）的影響Fig.2 Effect of different probiotics on ovarium morphological (a) and its histological observation (b) in PCOS rats

表2 不同益生菌干預(yù)對(duì)各組大鼠卵巢黃體數(shù)以及囊性卵泡數(shù)的影響Table 2 Effect of different probiotics on number of ovarian luteal bodies and cystic follicles in each group

2.4 不同益生菌干預(yù)對(duì)PCOS 大鼠卵巢纖維化的改善程度

卵巢組織的Masson 染色結(jié)果如圖3所示。與正常組相比，PCOS 組大鼠卵泡膜周圍呈高度纖維化，且膠原纖維由黃體膜顆粒滲入黃體顆粒細(xì)胞。與PCOS 組相比，乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組、植物乳桿菌組大鼠卵巢纖維化程度均有明顯改善。結(jié)果提示，乳雙歧桿菌、丁酸梭菌、植物乳桿菌均能改善PCOS 大鼠的卵巢纖維化癥狀。

圖3 不同益生菌干預(yù)對(duì)PCOS 大鼠卵巢纖維化程度的影響Fig.3 Effect of different probiotics on the degree of ovarian fibrosis in PCOS rats

2.5 不同益生菌干預(yù)后各組大鼠血清性激素水平的變化

高雄激素血癥是PCOS 重要的病理特征之一，過高的雄激素水平可加劇性激素分泌紊亂，造成排卵障礙[1]。正常情況下，LH 與卵泡膜細(xì)胞上的LH 受體結(jié)合生成T，同時(shí)FSH 可激活顆粒細(xì)胞中芳香化酶的活性致使T 進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為E2。而PCOS 的卵巢病變可導(dǎo)致下丘腦-垂體-卵巢軸（HPO）功能發(fā)生異常，刺激垂體生成更多的LH并抑制FSH 的分泌，造成T 和LH/FSH 比值升高[21]。此外，血清中異常升高的胰島素也可與胰島素樣生長(zhǎng)因子共同作用于卵泡膜細(xì)胞，造成體內(nèi)T 的過度生成[22]。研究發(fā)現(xiàn)，腦腸介質(zhì)如胃饑餓素（Ghrelin）、酪酪肽（Peptide Tyrosine Tyrosine，PYY）和生殖生理的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)之間存在相互作用[23]。Liu 等[24]發(fā)現(xiàn)，PCOS 患者Ghrelin 和PYY 水平顯著降低，且與T 呈負(fù)相關(guān)。益生菌作為一種腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，可通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)影響Ghrelin 和PYY 的分泌，并由此參與腦-腸互動(dòng)，從而降低異常升高的LH 和T 水平[25-27]。如表3所示，PCOS 組大鼠血清T、LH 和LH/FSH 比值較正常組顯著升高（p＜0.05）；E2 和FSH 水平顯著降低（p＜0.05），這與Kafili 等[28]的研究結(jié)果一致。與PCOS 組相比，乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組、植物乳桿菌組大鼠血清T 水平分別下降25.87%、30.11%、38.29%且具有顯著性差異（p＜0.05）；LH 水平分別下降25.26%、24.42%、31.08%（p＜0.05）；LH/FSH 比值分別下降25.45%、24.24%、23.64%且具有顯著性差異（p＜0.05），其中以植物乳桿菌的干預(yù)效果最好。此外，植物乳桿菌能顯著升高PCOS 大鼠血清中的E2、FSH 水平分別至49.94 ng/L、18.73 IU/L，丁酸梭菌能顯著升高FSH 水平至17.77 IU/L（p＜0.05）。上述結(jié)果提示，乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組、植物乳桿菌均能有效調(diào)節(jié)PCOS 大鼠血清性激素水平。He 等[17]的研究結(jié)果也提示，植物乳桿菌HL2 能顯著下調(diào)PCOS 大鼠體內(nèi)LH、FSH 和T 水平，這與本研究的結(jié)果相一致。

表3 不同益生菌干預(yù)對(duì)各組大鼠血清激素水平的影響Table 3 Effect of different probiotics on serum levels of sex hormone in PCOS rats

2.6 不同益生菌干預(yù)對(duì)各組大鼠空腹血糖、胰島素及HOMA-IR 的變化

胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）同樣也是PCOS的主要病理生理事件之一[21]，持續(xù)的IR 狀態(tài)會(huì)加重PCOS 的病理進(jìn)程，并引起糖耐量異常，進(jìn)而發(fā)展為糖尿病和心血管疾病[29,30]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致腸道內(nèi)LPS 的大量生成，并通過破壞腸黏膜屏障升高體循環(huán)中的LPS，進(jìn)而引發(fā)代謝內(nèi)毒素血癥，最終導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)和IR 的發(fā)生[8,31]。由表4可知，相比正常組，PCOS 組大鼠血清INS、LPS 水平和HOMA-IR 指數(shù)顯著上升23.82%、66.9%和22.18%（p＜0.05），而血糖水平與正常組未有較大差異，其原因可能是PCOS 大鼠通過代償性分泌胰島素來維持血糖水平。與PCOS 組相比，乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組、植物乳桿菌組大鼠血清INS 水平分別顯著下降20.01%、26.22%、14.24%，LPS 水平分別下降72.03%、58.35%、62.78%且具有顯著性差異，HOMA-IR 指數(shù)分別下降12.57%、24.58%、18.99%且具有顯著性差異（p＜0.05），其中INS、HOMA-IR 以丁酸梭菌的干預(yù)效果最好，LPS 水平以乳雙歧桿菌干預(yù)效果最好。各干預(yù)組之間INS、LPS 和HOMA-IR 均無顯著性差異。上述結(jié)果提示益生菌可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)降低血清LPS 水平，進(jìn)而緩解全身炎癥反應(yīng)，達(dá)到改善IR 的目的。Ahmadi 等[32]發(fā)現(xiàn)，服用12 周的益生菌補(bǔ)充劑可顯著降低PCOS 患者血清FPG、INS 水平和HOMA-IR 指數(shù)，改善其代謝水平。同時(shí)，也有研究指出而給予嬰兒乳雙歧桿菌及酪酸梭菌則可有效降低肥胖小鼠體內(nèi)LPS 水平[16]。陳燁等[33]的研究也發(fā)現(xiàn)，在給予PCOS 患者12 周的雙歧桿菌三聯(lián)活菌片（含乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌，糞腸球菌）治療后，患者INS 水平和HOMA-IR 均得到改善，這與本研究的結(jié)果相一致。

表4 不同益生菌干預(yù)對(duì)各組大鼠空腹血糖、胰島素及HOMA-IR 的變化Table 4 Effect of different probiotics on serum levels of FPG,INS and HOMA-IR in PCOS rats

2.7 益生菌干預(yù)對(duì)PCOS 大鼠血清脂代謝水平的影響

脂代謝異常作為PCOS 患者體內(nèi)常見的代謝紊亂之一，主要以血清中TC、TG 及LDL-C 水平升高，HDL-C 水平降低為特征[34]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)厚壁菌門數(shù)量的增加和擬桿菌門數(shù)量的減少可增加飲食中能量的獲取[35]。此外，腸道菌群失調(diào)可通過內(nèi)毒素血癥誘發(fā)慢性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致血脂紊亂進(jìn)一步加重[36]。由表5可知，與正常組相比，PCOS 組大鼠血清TG、TC、LDL-C 水平顯著升高（p＜0.05），HDL-C 水平顯著降低（p＜0.05）。相比PCOS 組，乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組、植物乳桿菌組大鼠血清TG 水平分別顯著降低42.72%、33.01%、31.06%；TC 水平分別降低39.45%、38.54%、41.67%且具有顯著性差異；LDL-C 水平分別降低53.67%、51.22%、49.24%且具有顯著性差異（p＜0.05），其中以乳雙歧桿菌的干預(yù)效果最好。此外，乳雙歧桿菌組HDL-C 水平較PCOS 組顯著下降（p＜0.05）。乳雙歧桿菌組、丁酸梭菌組和植物乳桿菌組之間TG、TC、LDL-C、HDL-C 均無顯著性差異（p＞0.05）。方圓圓等[16]的研究提示，嬰兒乳雙歧桿菌及酪酸梭菌可有效降低肥胖小鼠體內(nèi)TG、TC 和LDL-C 水平，同時(shí)升高HDL-C 水平，這與本研究的結(jié)果相一致。因此，可推測(cè)益生菌可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)減少攝入能量并改善全身炎癥狀態(tài)，從而達(dá)到改善血脂紊亂的目的。

表5 不同益生菌干預(yù)對(duì)各組大鼠血脂水平的影響(mmol/L)Table 5 Effect of different probiotics on serum levels of lipid in PCOS rats (mmol/L)

2.8 不同益生菌對(duì)PCOS 大鼠卵巢纖維化相關(guān)因子蛋白表達(dá)影響

卵巢纖維化是卵巢功能障礙的重要病理因素之一，可導(dǎo)致機(jī)體排卵障礙，激素紊亂甚至功能衰竭，其特征主要為白膜增厚和間質(zhì)結(jié)締組織增厚[37]。TGF-β1/Smads 信號(hào)通路已被證實(shí)在PCOS 卵巢纖維化中具有重要作用[38]。TGF-β1 首先與TGF-βⅡ型受體（TGF-βR2）結(jié)合激活TGF-βR1，活化的TGF-βR1 在細(xì)胞內(nèi)磷酸化Smad2 和Smad3，隨后磷酸化的Smad2、Smad3 與未磷酸化的Smad4 形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核[39]。TGF-β1 過度表達(dá)時(shí)，Smad2-Smad3-Smad4 復(fù)合物于細(xì)胞核大量積累，并引起細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）的大量沉積，進(jìn)而引發(fā)器官纖維化[40]。為進(jìn)一步探究三種益生菌對(duì)PCOS 大鼠卵巢纖維化的影響機(jī)制，檢測(cè)了Smad4、p-Smad3、p-Smad2 在卵巢中的表達(dá)。

由圖4可知，與正常組相比，PCOS 組大鼠卵巢中Smad4、p-Smad3、p-Smad2 蛋白表達(dá)水平均有顯著上升（p＜0.05）。與PCOS 組相比，乳雙歧桿菌組大鼠卵巢組織中Smad4、p-Smad3、p-Smad2 水平分別下降52.89%、65.31%、77.42%（p＜0.05）；丁酸梭菌組大鼠卵巢組織中Smad4、p-Smad3、p-Smad2 水平分別下降29.14%、65.82%、52.86%（p＜0.05）；植物乳桿組大鼠卵巢組織中Smad4、p-Smad3、p-Smad2 水平分別下降69.80%、78.57%、56.96%（p＜0.05）。以上結(jié)果提示，乳雙歧桿菌、丁酸梭菌、植物乳桿菌均能顯著下調(diào)PCOS 大鼠卵巢組織中Smad4、p-Smad3、p-Smad2的表達(dá)水平。Zhang 等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌可通過降低肝纖維化小鼠肝臟組織中p-Smad3、Smad4 的表達(dá)水平改善肝纖維化，這提示益生菌可通過抑制TGF-β1/smads 信號(hào)通路阻止卵巢纖維化的發(fā)生。

圖4 不同益生菌對(duì)PCOS 大鼠卵巢纖維化相關(guān)因子蛋白表達(dá)影響Fig.4 Effects of different probiotics on the protein expression of ovarian fibrosis-related factors in PCOS rats

3 結(jié)論

綜上所述，乳雙歧桿菌、丁酸梭菌、植物乳桿菌均可一定程度上改善來曲唑誘導(dǎo)PCOS 大鼠的癥狀，且三種益生菌對(duì)于PCOS 大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的改善程度不一，其中乳雙歧桿菌在調(diào)節(jié)脂代謝水平和方面具有優(yōu)勢(shì)，丁酸梭菌在改善IR 方面具有優(yōu)勢(shì)，植物乳桿菌在調(diào)節(jié)血清性激素水平方面具有優(yōu)勢(shì)。本研究為益生菌用于PCOS 的輔助治療提供了一定研究基礎(chǔ)。然而，益生菌改善PCOS 大鼠癥狀的具體機(jī)制尚未得到驗(yàn)證，后續(xù)有待完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步討論。