孫若蘭，易有金*，夏菠*，胡楠，鄧后勤，朱樹清，朱利紅，朱妮娜

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128）（2.汝城縣繁華食品有限公司，湖南郴州 424100）（3.汝城縣鑫利食品有限公司，湖南郴州 424100）（4.張家界洞溪七姊妹辣椒開發(fā)有限公司，湖南張家界 427209）

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）是引起辣椒采后病害的常見病原菌之一，最適生長溫度為24～26 ℃[1,2]。在侵染發(fā)病之前，辣椒疫霉菌具有2 d左右的潛伏期，因此采收時看起來健康的果實(shí)在采后貯藏和運(yùn)輸過程中可能會出現(xiàn)腐爛[3]。肖晶等[4]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒常溫貯存5 d 后，果身可出現(xiàn)疫霉病害癥狀，15 d 后平均發(fā)病率為5%，在辣椒采后病害中排名第六。辣椒疫霉菌寄主廣泛，除侵染辣椒之外，還能夠侵染黃瓜、番茄和南瓜等其他茄果類蔬菜，因此使果蔬采后經(jīng)濟(jì)價(jià)值受到了較大的損失[5]。目前，暫未見關(guān)于采后辣椒疫霉菌的生物防治研究，所以開發(fā)一種安全、綠色且高效的辣椒采后疫霉病抑制劑變得十分迫切[6]。

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一類常見于發(fā)酵食品、人類胃腸道中的益生菌，能通過發(fā)酵多種碳源產(chǎn)生具有抑菌能力的有機(jī)酸和細(xì)菌素，具有抗氧化、改善腸道環(huán)境、抗菌保鮮的功效[7-9]。因具有公認(rèn)的安全狀態(tài)（GRAS），乳酸菌被認(rèn)為是抑制食品真菌生長及霉菌毒素產(chǎn)生的天然防腐劑，成為了許多傳統(tǒng)化學(xué)殺菌藥劑的替代品[10-12]。近年來，使用乳酸菌及其代謝產(chǎn)物對果蔬采后抑菌及保鮮的研究逐漸深入，已被證實(shí)具有抑制真菌效果的乳酸菌主要有植物乳桿菌、乳酸鏈球菌、鼠李糖乳桿菌等[13]。Xiang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳桿菌F17 和乳酸明串珠菌H52對霉菌和大腸菌群具有明顯的抑制作用，具有草莓采后保鮮效果。Melo 等[15]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵液對櫻桃番茄采后致病鐮刀菌、黑曲霉菌和匍匐根霉菌具有抑制效果，然而，關(guān)于乳酸菌及其代謝產(chǎn)物對辣椒采后疫霉病的生物防治研究尚未見報(bào)道。

鑒于此，本研究旨在從發(fā)酵蔬菜中分離篩選出一株對辣椒疫霉菌具有明顯抑菌效果的乳酸菌，并對該乳酸菌進(jìn)行菌種鑒定、對其產(chǎn)酸能力進(jìn)行測定。研究發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌的抑制效果以及理化性質(zhì)，為抑制辣椒疫霉菌生長和防控辣椒采后疫霉病提供乳酸菌菌種資源及數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

蔬菜原材料（辣椒、豇豆、白蘿卜、黃瓜、卷心菜、甘薯）購于湖南省衡陽市。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院贈予。辣椒根霉菌（Rhizopusspp.）、辣椒紅色炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、辣椒黑色炭疽菌（Colletotrichum nigrum）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

MRS 肉湯、營養(yǎng)肉湯（NB）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；腦心浸液肉湯（BHI）杭州百思生物技術(shù)有限公司；以上培養(yǎng)基加入18 g 瓊脂粉即配制為相對應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

碳酸鈣、氯化鈉、明膠、體積分?jǐn)?shù)30%過氧化氫（分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶福州飛凈生物科技有限公司；Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒、SanPrep 柱式DNAJ 膠回收試劑盒、DNA Ladder Mix maker、dNTP 生工生物工程（上海）有限公司；氨芐青霉素鈉上海瑞永生物科技有限公司；多菌靈江蘇達(dá)捷生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

凈化工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；7200分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；LRH-250智能生化培養(yǎng)箱，上海飛躍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HR/T16M 臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；HR/T16M 臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；FD-1-50 真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 自然發(fā)酵蔬菜制作

將辣椒、豇豆、白蘿卜、黃瓜、卷心菜、甘薯洗凈切分晾曬至表面無水分后入壇，加入5%（m/m）食用鹽，冷開水浸沒蔬菜，密封壇蓋，室溫靜置發(fā)酵14 d；或加入8%（m/m）食用鹽至上述晾干蔬菜表面，進(jìn)行鹽漬處理，室溫靜置發(fā)酵14 d。

1.3.2 乳酸菌初步分離

采用稀釋涂布平板法，取10 g 采集樣品至50 mL無菌0.85%（m/V）NaCl，旋渦混勻，依次進(jìn)行10-1～10-4濃度梯度的稀釋。各梯度取100 μL 涂布在含2%CaCO3（m/V）的MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h～72 h。挑取具有明顯溶鈣圈的菌落，多次劃線純化直至菌落形態(tài)單一、鏡檢無雜菌，將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的乳酸菌株，4 ℃斜面保藏備用。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵上清液制備

取保藏菌株，經(jīng)MRS 肉湯活化兩次后，以3%添加量添加菌株至MRS 肉湯，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，8 000 r/min 離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃保存。

1.3.4 乳酸菌篩選

采用固體稀釋法，待PDA 培養(yǎng)基冷卻至55 ℃左右，以發(fā)酵上清液為試驗(yàn)組、無菌水為對照，按照1:9（V:V）的比例（發(fā)酵上清液為1，PDA 培養(yǎng)基為9）將發(fā)酵上清液與培養(yǎng)基混合均勻，每平皿注入約20 mL 混合液。培養(yǎng)基冷卻凝固后，在中央加入一塊4 mm 辣椒疫霉菌菌餅，28 ℃正置培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量菌落生成直徑，并代入公式計(jì)算菌落生長抑制率，記錄抑菌效果最佳的菌株，-80 ℃甘油凍存管保藏菌株備用。

式中：

B——菌落生長抑制率，%；

d0——對照組菌落直徑，mm；

d1——試驗(yàn)組菌落直徑，mm。

1.3.5 菌株鑒定

參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[16]對篩選菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，使用Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒進(jìn)行菌株基因組DNA 提??；選用細(xì)菌通用引物27F：5'-AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3'，1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；PCR 產(chǎn)物經(jīng)1wt%瓊脂糖凝膠電泳純化后，交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA 序列比對鑒定。

1.3.6 乳酸菌生長曲線、產(chǎn)酸能力

于超凈臺挑取一環(huán)菌落接入30 mL MRS 肉湯，靜置培養(yǎng)18 h 作為種子培養(yǎng)液，以5%的接種量轉(zhuǎn)移至新鮮MRS 肉湯，37 ℃靜置培養(yǎng)，在0、2、4、6、8、10、16、22、28、34、40、46、52、58 h 取樣，測定pH 值及其在600 nm 處吸光度值，繪制變化曲線。

1.3.7 發(fā)酵上清液理化性質(zhì)

1.3.7.1 過氧化氫酶敏感性

在菌株O2 的發(fā)酵上清液中加入過氧化氫酶，使其終濃度為5 mg/mL，37 ℃水浴24 h 后，80 ℃水浴處理5 min 對酶滅活，恢復(fù)室溫后0.22 μm 濾膜過濾除菌，按照“1.3.4”進(jìn)行抑菌檢測，以不做任何處理為對照。

1.3.7.2 蛋白酶敏感性

使用6 mol/L HCl 和10 mol/L NaOH 將發(fā)酵上清液pH 值分別調(diào)至蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶最適pH值，以1 mg/mL 的濃度分別添加三種蛋白酶至上清液，37 ℃水浴2 h 后，調(diào)節(jié)pH 值至上清液原濃度，以不做任何處理為對照，按照“1.3.4”進(jìn)行抑菌檢測。

1.3.7.3 熱穩(wěn)定性測定

發(fā)酵上清液分別于40、60、80、100、120 ℃條件下加熱30 min，以不做任何處理的室溫為對照，按照“1.3.4”進(jìn)行抑菌檢測。

1.3.7.4 紫外線照射敏感性

取發(fā)酵上清液置于15 W 紫外燈25 cm 處，分別照射30、60、90、120、150 min，以未處理發(fā)酵上清液作為對照，按照“1.3.4”進(jìn)行抑菌檢測。

1.3.7.5 酸堿穩(wěn)定性

使用6 mol/L HCl 和10 mol/L NaOH 于室溫下將發(fā)酵上清液pH 值分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，用無菌水定容發(fā)酵上清液至同等體積作為對照（pH 值3.60），0.22 μm 濾膜過濾除菌后按照“1.3.4”進(jìn)行抑菌檢測；

1.3.8 發(fā)酵上清液凍干制備

菌株O2 以3%添加量添加至MRS 肉湯，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后取10 mL分裝于50 mL離心管，-80 ℃預(yù)冷12 h，冷凍干燥48 h 后得到褐色蜂窩狀凍干，置于-80 ℃保藏備用。

1.3.9 發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）

稱取適量發(fā)酵上清液凍干粉溶解于PDB 培養(yǎng)基中，采用二倍稀釋法分別配制成256.0、128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0 mg/mL 九個濃度梯度，以無菌水為對照，使用0.22 μm 濾膜過膜除菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。按照?.3.4”方法進(jìn)行處理，使發(fā)酵上清液終濃度分別為25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0 mg/mL，以無疫霉菌生長的最低發(fā)酵上清液濃度為最小抑菌濃度。在最小抑菌濃度試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，以在14 d 內(nèi)無辣椒疫霉菌生長的最低發(fā)酵上清液濃度為最小殺菌濃度。

1.3.10 發(fā)酵上清液抑菌譜

1.3.10.1 發(fā)酵上清液對辣椒采后致病菌的抑菌作用

辣椒采后致病菌抑菌試驗(yàn)以乳酸菌發(fā)酵上清液為試驗(yàn)組、無菌MRS 肉湯為對照、5 μg/mL 多菌靈為陽性對照，無菌水為空白對照，按“1.3.4”進(jìn)行抑菌檢測。

1.3.10.2 發(fā)酵上清液對常見食源性致病菌的抑菌作用

食源性致病菌抑菌試驗(yàn)采用牛津杯法[17]，每平皿傾注20 mL 培養(yǎng)基（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌使用NA 培養(yǎng)基；志賀氏菌、阪崎腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌使用BHI 培養(yǎng)基），調(diào)整致病菌濃度至每毫升1×108個，每平皿涂布100 μL菌懸液，靜置5 min 后，將無菌牛津杯置于固體培養(yǎng)基表面，添加100 μL 發(fā)酵液至牛津杯，同時以無菌MRS 肉湯作為對照，以100 μg/mL 氨芐青霉素鈉作為陽性對照，4 ℃靜置4 h 后，37 ℃靜置16 h，測量抑菌圈直徑，每個處理重復(fù)三次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010 與SPSS 20 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析，使用OriginPro 2021 進(jìn)行圖片繪制，顯著性分析采用Tukey test 法，p＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌篩選

本試驗(yàn)從不同自制發(fā)酵蔬菜中初步篩選出生長良好的乳酸菌8 株，分別命名為C1、E2、G1、G2、M1、O1、O2、P1。采用固體稀釋法，從8 株菌株中篩選一株對辣椒疫霉菌具有抑菌活性乳酸菌，結(jié)果見圖1。

圖1 不同乳酸菌對辣椒疫霉菌的菌落生長抑制率Fig.1 The colony growth inhibition rate of different lactic acid bacteria against Phytophthora capsici

PDA 培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d 后，加有無菌水的對照組辣椒疫霉菌菌落生長直徑為（79.01±0.13）mm，加有菌株C1、E2、G1、G2、M1、O1、O2、P1 發(fā)酵上清液的試驗(yàn)組辣椒疫霉菌菌落生長直徑分別為44.94、40.06、29.71、34.92、19.86、42.48、10.13、39.92 mm。其中，加有菌株O2 發(fā)酵上清液的試驗(yàn)組對辣椒疫霉菌的抑制效果最佳，與C1、E2、G1、G2、M1、O1、O2、P1 試驗(yàn)組、無菌水對照組相比，差異顯著（p<0.05），對疫霉菌的生長抑制率為87.18%，因此選取菌株O2 進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 菌株O2 發(fā)酵液在PDA 培養(yǎng)基對辣椒疫霉菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of strain O2 fermentation broth on Phytophthora capsici in PDA

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

如圖3a，O2 在2% CaCO3（m/V）MRS 固體培養(yǎng)基呈乳白色菌落，周邊具有典型溶鈣圈，菌落呈圓形、邊緣整齊、表面光滑且濕潤、中央隆起、不透明；在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體革蘭氏染色呈陽性、長約6～10 μm，無芽孢、無莢膜、無鞭毛（圖3b）。

圖3 菌株O2 在2% CaCO3 MRS 培養(yǎng)基菌落形態(tài)(a)與菌體形態(tài)(×1 000)(b)Fig.3 O2 Colony morphology (a) and cell morphology (×1 000)(b) in 2% CaCO3 MRS

2.2.2 生理生化特征鑒定

由表1可知，菌株O2 碳水化合物反應(yīng)皆為陽性，觸酶試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、H2S 試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)皆為陰性，在pH 值4.5、pH 值6.5、4%～8% NaCl、10 ℃、15 ℃環(huán)境下正常生長，45 ℃生長停滯。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）中乳桿菌科描述，菌株O2 生理生化試驗(yàn)的結(jié)果與乳桿菌屬植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）描述相符合。

表1 菌株O2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 O2 results of physiological and biochemical tests

2.2.3 16S rDNA 序列比對鑒定

如圖4，菌株O2 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1wt%瓊脂糖凝膠電泳純化后，在1 500 bp 處出現(xiàn)特異清晰的單一條帶。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析獲得16S rDNA 基因序列，將O2 菌株16S rDNA 基因序列上傳至BLAST，使用GenBank 搜索同源性高的相似菌株16S rDNA 序列進(jìn)行相似性分析，在MEGA X 軟件中使用Neighbor-Joining（N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，O2 菌株與植物乳桿菌同源性為98%，鑒定O2 菌株為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum（GenBank 登陸號為OL616071）。

圖4 菌株O2 PCR 產(chǎn)物電泳圖(a)與系統(tǒng)發(fā)育樹(b)Fig.4 O2 Electrophoretic map of PCR products (a) and phylogenetic tree (b)

2.3 植物乳桿菌O2 生長曲線及產(chǎn)酸能力

如圖5，植物乳桿菌O2 在0～58 h 培養(yǎng)時間內(nèi)的生長曲線主要表現(xiàn)為3 個階段：0～2 h 為菌株O2 的生長延滯期，此時期細(xì)菌數(shù)目增加不明顯，OD600值從0.437 上升至0.456；2～28 h 為生長對數(shù)期，菌體代謝旺盛，菌體數(shù)量呈幾何級數(shù)增加，OD600值從0.456 上升至8.716（發(fā)酵液原液稀釋OD600值至0.5～0.6 左右后再乘以稀釋倍數(shù)）；28～58 h 為生長穩(wěn)定期，隨著培養(yǎng)時間的延長細(xì)菌增長速度逐漸趨向于零，OD600值從8.716 降低至7.833。植物乳桿菌O2 在0～58 h 培養(yǎng)時間內(nèi)的產(chǎn)酸能力與其生長曲線的變化相吻合，在0～2 h 內(nèi)，發(fā)酵液pH 值出現(xiàn)緩慢降低，從5.18 降至5.10；在2～28 h 內(nèi)，隨著細(xì)菌進(jìn)入生長對數(shù)期，菌體內(nèi)酶系活躍，迅速產(chǎn)酸，發(fā)酵液pH 值從5.10 迅速下降至3.64；在28～58 h 內(nèi)，發(fā)酵液pH 值逐漸趨于穩(wěn)定維持在3.60。

圖5 植物乳桿菌O2 在MRS 肉湯中的生長曲線和產(chǎn)酸曲線Fig.5 Lactobacillus plantarum O2 growth curve and acid production curve in MRS

2.4 發(fā)酵上清液理化性質(zhì)

2.4.1 發(fā)酵上清液過氧化氫酶、蛋白酶敏感性

乳酸菌可產(chǎn)生過氧化氫、黏蛋白以及細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物，通過破壞細(xì)胞膜、羥基自由基等方法抑制致病菌生長繁殖[18,19]。如圖6a 所示，經(jīng)過氧化氫酶、蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理的O2 發(fā)酵上清液的菌落生長抑制率與未經(jīng)處理的原液相比，菌落生長抑制率無顯著差異（p＞0.05）。說明O2 發(fā)酵上清液對過氧化氫酶、蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感，這與黃曉英等[20]的結(jié)果相同。

圖6 不同方式處理植物乳桿菌O2 發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌生長抑制率的影響Fig.6 Effect of differents treatment of Lactobacillus plantarum O2 fermentation supernatant on growth inhibition rate of Phytophthora capsici

2.4.2 發(fā)酵上清液熱穩(wěn)定性測定

抑菌劑的適用范圍主要受溫度的影響，Digaitiene等[21]研究發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌KTU05-6 具有良好的熱穩(wěn)定性，即使在100 ℃下處理60 min 其抑菌物質(zhì)也能保持穩(wěn)定。本試驗(yàn)分別在40、60、80、100、120 ℃條件下處理上清液30 min，如圖6b 所示，在40～120 ℃的溫度范圍內(nèi)，O2 發(fā)酵上清液對疫霉菌生長抑制率與發(fā)酵上清液原液的差異不顯著（p＞0.05），證明發(fā)酵上清液的主要抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.4.3 發(fā)酵上清液紫外線照射敏感性

紫外線敏感試驗(yàn)同熱穩(wěn)定性試驗(yàn)相似，其測定結(jié)果對抑菌物質(zhì)的應(yīng)用范圍有所影響。Banerjee 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射對短乳桿菌FPTLB3 的抑菌成分無影響。如圖6c 所示，O2 發(fā)酵上清經(jīng)15 W 紫外燈照射30、60、90、120 及150 min 處理后，對疫霉菌生長抑制率分別為87.87%、87.06%、86.11%、87.63%和 87.09%，與發(fā)酵上清液原液的差異不顯著（p＞0.05），證明O2 發(fā)酵上清液的主要抑菌物質(zhì)在15 W 紫外線下不敏感，這與Banerjee 的結(jié)果一致。

2.4.4 發(fā)酵上清液酸堿穩(wěn)定性測定

大多數(shù)有機(jī)酸在酸性條件具有最高抑菌活性，通過測定發(fā)酵上清液對酸堿的耐受程度，可進(jìn)一步鑒別抑菌物質(zhì)最高抑菌活性的范圍，對抑菌物質(zhì)純化鑒定也有著重大意義[23]。如圖6d 所示，在O2 發(fā)酵上清液pH 值為2～3 時，發(fā)酵上清液對疫霉菌生長抑制率為100%，與對照組的抑制率相比有顯著差異（p＜0.05）。隨著O2 發(fā)酵上清液pH 值的升高，菌生長抑制率逐漸降低，當(dāng)pH 值為5 時，發(fā)酵上清液已無法抑制疫霉菌的生長，且當(dāng)pH 值＞6 時，堿性環(huán)境下的某些物質(zhì)促進(jìn)了疫霉菌的生長。說明O2 發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌的主要抑菌物質(zhì)在pH 值＜5 時有較好的穩(wěn)定性。

2.5 發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）測定

取冷凍干燥后發(fā)酵上清進(jìn)行稱重，經(jīng)測定每10 mL 發(fā)酵上清液凍干后質(zhì)量為494.6 mg，凍干轉(zhuǎn)化率為49.46 mg/mL。取適量發(fā)酵上清液凍干溶解于PDB 中，采用二倍稀釋法進(jìn)行MIC 和MBC 測定，結(jié)果如表2和圖7所示，從質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 開始，O2 發(fā)酵上清液對疫霉菌的生長出現(xiàn)顯著抑制作用（p＜0.05），菌落生長抑制率達(dá)到7.87%。隨著PDA培養(yǎng)基中植物乳桿菌O2 發(fā)酵上清液含量的上升，疫霉菌的菌落生成直徑逐漸減小，其對疫霉菌的生長抑制率逐漸上升。當(dāng)O2 發(fā)酵上清液質(zhì)量濃度達(dá)到12.8 mg/mL 后，菌落生長抑制率達(dá)到100%，7 d 內(nèi)未見菌絲生長，故確定12.8 mg/mL 為菌株O2 發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌的MIC。由表2可知，28 ℃培養(yǎng)14 d時，質(zhì)量濃度為12.8 mg/mL 的O2 發(fā)酵上清液對疫霉菌的生長抑制率為91.30%，具有較好的抑菌效果，但要使疫霉菌生長抑制率達(dá)到100%，需進(jìn)一步提高O2發(fā)酵上清液質(zhì)量濃度至25.6 mg/mL，故25.6 mg/mL為菌株O2 發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌的MBC。

圖7 植物乳桿菌O2 發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌的MICFig.7 The MIC of Lactobacillus plantarum O2 fermentation to Phytophthora capsici

表2 植物乳桿菌O2 發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌的最小殺菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）Table 2 The MIC and MBC of Lactobacillus plantarum O2 fermentation to Phytophthora capsici

MIC 和MBC 分別表示最小抑制病原微生物繁殖或殺滅病原微生物生存的藥物濃度，用于定量表示抑菌劑的抑菌或殺菌性能[24]。胡誠[25]采用液體二倍稀釋法對輪枝鐮孢菌孢子進(jìn)行MIC 測定，研究表明當(dāng)乳酸菌上清液含量在8 mg/mL及以上時可抑制輪枝鐮孢菌菌絲生長，使液體培養(yǎng)基保持清澈透明。致病菌和乳酸菌的種類是影響MIC 的重要因素，此外，不同的試驗(yàn)方法對MIC 的結(jié)果也具有顯著差異。因此可通過進(jìn)一步純化O2 上清液的抑菌物質(zhì)，以達(dá)到低劑量且高效的抑菌效果。

2.6 抑菌譜測定

2.6.1 辣椒采后致病菌抑菌試驗(yàn)

圖8 植物乳桿菌O2 發(fā)酵上清液抑菌譜Fig.8 The antibacterial spectrum of Lactobacillus plantarum O2 fermentation supernatant

辣椒疫霉菌、辣椒紅色炭疽菌、辣椒黑色炭疽菌以及根霉菌是辣椒采后常見的致病菌[26,27]，本試驗(yàn)用以上四種辣椒采后致病菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果由表3可知，O2 發(fā)酵上清液對4 種指示菌的菌落生長抑制率分別為87.18%、31.43%、0.00%和0.00%。其中，O2 發(fā)酵上清液對疫霉菌的生長抑制率最佳，優(yōu)于陽性對照組，差異顯著（p＜0.05）。其次，O2 發(fā)酵上清液對紅色炭疽菌的生長抑制率可達(dá)到陽性對照組抑菌效果，差異不顯著（p＞0.05）。O2 發(fā)酵上清液對于辣椒黑色炭疽菌和根霉菌無抑制效果，且根霉菌抑菌試驗(yàn)中四組試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著（p＞0.05）。Cortes-Zavaleta 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌NRRL B-4496 發(fā)酵上清液對紅色炭疽菌的生長抑制率較低，25 ℃培養(yǎng)4 d 后僅為8.63%，遠(yuǎn)低于嗜酸乳桿菌（41.57%）對紅色炭疽菌的抑制效果。與上述研究結(jié)果比較，本試驗(yàn)中O2 發(fā)酵上清液對紅色炭疽菌展現(xiàn)出明顯的抑菌效果。

表3 植物乳桿菌O2 發(fā)酵上清液對辣椒采后致病菌抑菌譜Table 3 The antibacterial spectrum of Lactobacillus plantarum O2 fermentation supernatant on postharvest capsicum pathogens

2.6.2 常見食源性致病菌抑菌試驗(yàn)

大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、和志賀氏菌是果蔬、乳制品及肉制品中的主要致病菌，可導(dǎo)致人體產(chǎn)生發(fā)熱、嘔吐以及腹瀉等癥狀[29,30]。阪崎腸桿菌常見于嬰幼兒配方奶粉及乳制品中，嬰幼兒誤食阪崎腸桿菌污染的乳制品后會引起嬰兒腦膜炎、膿血癥等病癥[31]。本試驗(yàn)用以上六種食源性致病菌為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，由表4可知，O2 發(fā)酵上清液對6 種指示菌的抑菌直徑分別為11.06、10.06、13.56、14.38、18.40、13.20 mm。與對照組相比，試驗(yàn)組對六種食源性致病菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果均具有顯著差異（p＜0.05）。與陽性對照組相比較，在沙門氏菌和志賀氏菌抑菌試驗(yàn)中，試驗(yàn)組抑菌效果優(yōu)于陽性對照組，差異顯著（p＜0.05）；在大腸桿菌和阪崎腸桿菌抑菌試驗(yàn)中，試驗(yàn)組抑菌效果與陽性對照組差異不顯著（p＞0.05），證明O2 發(fā)酵上清液的抑菌物質(zhì)對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌和阪崎腸桿菌這四種食源性致病菌具有良好的抑制效果。

表4 植物乳桿菌O2 發(fā)酵上清液對常見食源性致病菌抑菌譜Table 4 The antibacterial spectrum of Lactobacillus plantarum O2 fermentation supernatant on common foodborne pathogens

Monika 等[32]對傳統(tǒng)泡菜中分離到的15 株乳酸菌進(jìn)行食源性致病菌抑菌試驗(yàn)，研究結(jié)果顯示植物乳桿菌PKL-21 比糞腸球菌和腸系膜明串珠菌有更好的抑菌特性，對大腸桿菌、志賀桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為13.1、12.86、8.3 mm。與上述研究結(jié)果相比較，O2 發(fā)酵上清液對大腸桿菌的抑菌效果稍差一些，但對志賀桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果更好，且抑菌譜更廣。

3 結(jié)論

從自制發(fā)酵蔬菜中初步篩選出8 株乳酸菌，通過固體稀釋法篩選出一株對辣椒疫霉菌具有明顯抑菌效果的乳酸菌O2，其發(fā)酵上清液對辣椒疫霉菌抑制率為87.18%，經(jīng)16S rDNA 和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。植物乳桿菌對O2過氧化氫酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感，在溫度40～120 ℃、15 W 紫外燈照射30～150 min 和pH 值＜5 范圍內(nèi)抑菌物質(zhì)穩(wěn)定，對辣椒疫霉的MIC和MBC 分別為12.8 mg/mL 和25.6 mg/mL。此外，O2 發(fā)酵上清液對紅色炭疽菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌和阪崎腸桿菌具有顯著抑制效果，后續(xù)可通過純化鑒定深入研究該乳酸菌的抑菌成分及抑菌機(jī)理，進(jìn)一步探究其對辣椒采后保鮮的效果，為開發(fā)辣椒采后防腐保鮮劑建立一定的基礎(chǔ)。