何春嫻，陳靖枝，楊靜玲，李舂龍,3，馬曉莉,3，南澤東,3，江志波,3

(1.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108；2.北方民族大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，化工技術(shù)基礎(chǔ)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏低品質(zhì)資源高值化利用技術(shù)研發(fā)人才小高地，寧夏 銀川 750021)

寧夏枸杞LyciumbarbarumL.與枸杞L.chinenseMill.的干燥根皮均作為中藥地骨皮在臨床上使用[1]。地骨皮無毒、味甘、性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有涼血除蒸、清肺降火之功效，臨床上常用于治療陰虛潮熱、骨蒸盜汗、內(nèi)熱消渴等病癥[2]。目前，對地骨皮的化學(xué)成分和藥理活性的研究主要集中于枸杞的干燥根皮，而對寧夏枸杞根皮的研究則鮮有報(bào)道。研究表明[2-8]，以枸杞干燥根皮為來源的地骨皮粗提物包含萜類、甾醇類、有機(jī)酸、生物堿、環(huán)肽類等化學(xué)成分，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗菌、抗病毒等多種藥理活性。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術(shù)因具有高靈敏度、低檢出限等優(yōu)點(diǎn)，在復(fù)雜樣品分析檢測中發(fā)揮了重要作用，已成為中草藥研究的重要工具[9]。隨著人們對中藥化學(xué)成分研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)的化合物數(shù)量已超過百萬種，發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)、新活性化合物的難度不斷增加[10]。對復(fù)雜的海量HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)的高通量分析和處理制約了串聯(lián)質(zhì)譜在中草藥分析中的應(yīng)用，如果不能將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀，必將造成數(shù)據(jù)浪費(fèi)[11]。因此，需要開發(fā)新方法分析中草藥中的微量化學(xué)成分。

近年來，分子網(wǎng)絡(luò)化(MN)作為化合物分析的重要輔助手段，在復(fù)雜樣品的化學(xué)成分識別、檢測和分離技術(shù)等方面得到了廣泛應(yīng)用[12-13]。它基于不同串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中相似或相同的碎片離子和中性丟失可能代表結(jié)構(gòu)(片段)的相似或相同，從而將結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物按照相似程度進(jìn)行可視化聚類。目前，分子網(wǎng)絡(luò)化分析是在GNPS(global natural products social molecular networking, https:∥gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp)網(wǎng)站實(shí)現(xiàn)的。GNPS是由全世界質(zhì)譜學(xué)家聯(lián)合組織的基于網(wǎng)絡(luò)的質(zhì)譜系統(tǒng)，迄今為止已形成包含近70萬種化合物的MS/MS免費(fèi)數(shù)據(jù)庫，可對樣品的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，將具有相似結(jié)構(gòu)的化合物網(wǎng)絡(luò)化聚類[14]，以成簇發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物，為全面研究復(fù)雜的HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)提供幫助。因此，分子網(wǎng)絡(luò)化可實(shí)現(xiàn)對中草藥的常量化合物的結(jié)構(gòu)排重、微量化合物的結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)類似物的聚類分析。Liang等[12,15-16]將分子網(wǎng)絡(luò)化技術(shù)應(yīng)用于微生物化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)和天然藥物化學(xué)，分析了不同物種中的微量化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)了尿苷肽類、黃酮類、皂苷類和二萜生物堿類等多種化學(xué)成分。

本研究擬基于高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF MS)和分子網(wǎng)絡(luò)化技術(shù)分析寧夏枸杞根皮水提物的化學(xué)成分，旨為寧夏枸杞根皮來源地骨皮的質(zhì)量控制提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Agilent 6530 Q-TOF系統(tǒng)(包含電噴霧離子源、自動進(jìn)樣器、柱溫箱)、ZORBAX Extend C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：美國Agilent公司產(chǎn)品；FA1004N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 樣品與試劑

寧夏枸杞根皮：2021年采自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市中寧縣，由北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院任玉峰教授鑒定為寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的根皮，現(xiàn)保存于北方民族大學(xué)植物標(biāo)本室(標(biāo)本號為NMUDGP-20190718-1)。

乙腈：色譜純，上海泰坦公司產(chǎn)品；屈臣氏蒸餾水：深圳屈臣氏蒸餾水有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙醇：分析純，北京化工廠產(chǎn)品；Sep-Pack C18固相萃取柱：美國Waters公司產(chǎn)品。

1.3 供試品溶液的制備

稱取20.0 g干燥寧夏枸杞根皮，浸泡于100 mL純水中，油浴加熱至微沸(油溫控制在100 ℃)，提取2 h后，用紗布過濾，收集濾液。重復(fù)提取濾渣3次，合并所有濾液，減壓蒸餾(< 40 ℃)至殘留液體積約為100 mL。取10.0 mL殘留液于15.0 mL離心管，以3 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至10.0 mL注射器中，連接Sep-Pak C18固相萃取柱，依次使用2 mL純水、50%甲醇水溶液和純甲醇進(jìn)行洗脫，其中50%甲醇水洗脫液用于HPLC-Q-TOF MS分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 Agilent ZORBAX Extend C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：A為水，B為乙腈；等度洗脫條件：0～40 min (5%～95%B)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子檢測模式；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化氣壓力310 kPa；毛細(xì)管電壓4.5 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z100～300、300～2 000。

1.5 分子網(wǎng)絡(luò)化分析條件

采用ProteoWizard軟件將HPLC-MS/MS采集得到的原始二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)化為mzXML格式，在GNPS上建立分子網(wǎng)絡(luò)；運(yùn)用Cytoscape軟件使其可視化，然后借助GNPS平臺分析分子網(wǎng)絡(luò)化，得出已知化合物；再根據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的相關(guān)性，比較相關(guān)節(jié)點(diǎn)間質(zhì)譜數(shù)據(jù)的異同，得出已知化合物的類似物或其他未知物。

計(jì)算參數(shù)設(shè)置：MS/MS碎片離子容差為0.5 u；母離子的m/z公差為1.0；最小余弦分?jǐn)?shù)為0.6；最小匹配碎片離子為4個(gè)；網(wǎng)絡(luò)TOPK為10。使用Cytoscape 3.4.0軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 總離子流圖分析

寧夏枸杞根皮在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖示于圖1?？梢钥闯?，低質(zhì)量數(shù)(m/z100～300，圖1a,1b)的離子峰數(shù)量比高質(zhì)量數(shù)(m/z300～2 000，圖1c,1d)的少，且正離子模式下最高峰豐度大于負(fù)離子模式下最高峰豐度。保留時(shí)間主要位于10～30 min，結(jié)合固相萃取處理時(shí)50%甲醇水溶液洗脫，推測樣品中的化合物以中等極性為主。通過分析二級質(zhì)譜碎片離子和特征丟失數(shù)據(jù)，并借助文獻(xiàn)[15]，鑒定了21個(gè)化合物，包括4個(gè)有機(jī)酸或酯類(1～4)、12個(gè)有機(jī)含氮化合物(5～16)和5個(gè)其他類型結(jié)構(gòu)(17～21)，列于表1。

注：a,b.m/z 100～300；c,d.m/z 300～2 000圖1 寧夏枸杞根皮在正(a,c)、負(fù)(b,d)離子模式的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms (TIC) of the root bark of Lycium barbarum L. in positive (a,c) and negative (b,d) modes

表1 HPLC-Q-TOF MS鑒定寧夏枸杞根皮化合物Table 1 Chemical compounds of the root bark of Lycium barbarum L. by HPLC-Q-TOF MS

續(xù)表1

續(xù)表1

2.1.1有機(jī)酸類化合物 有文獻(xiàn)[17]報(bào)道，利用系統(tǒng)化學(xué)分離的方法從枸杞干燥根皮來源的地骨皮提取物中分離得到31個(gè)有機(jī)酸及其酯類化合物。本研究在寧夏枸杞干燥根皮水提物的50%甲醇洗脫液中提取潛在有機(jī)酸化合物離子，根據(jù)二級質(zhì)譜圖的特征碎片離子，確定了4個(gè)已知的有機(jī)酸，示于圖2?；衔?、3、4為長鏈不飽和脂肪酸，通過中性丟失和特征裂解，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下m/z59離子可作為脂肪酸存在的證據(jù)之一。在化合物2、3、4中均發(fā)生CO2(44 u)的丟失，表明其結(jié)構(gòu)中存在酰氧基或羧基。

2.1.2有機(jī)含氮類化合物 早期人們對枸杞L.chinenseMill.的干燥根皮來源地骨皮的研究表明[17]，其含有豐富的有機(jī)含氮活性成分，包括莨菪烷型、吡啶型、精胺型、酰胺型等結(jié)構(gòu)，其中地骨皮甲素、地骨皮乙素、二氫咖啡酰酪胺、咖啡酰酪胺等酰胺類化合物備受關(guān)注。但對寧夏枸杞根皮來源地骨皮的有機(jī)含氮化合物的報(bào)道較少。本研究對寧夏枸杞根皮的地骨皮樣品進(jìn)行測定并提取數(shù)據(jù)，通過與枸杞干燥根皮含氮化合物的結(jié)構(gòu)對比，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)化合物的準(zhǔn)分子離子峰，以準(zhǔn)分子離子為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，推測它們的裂解途徑，結(jié)果示于圖3。在負(fù)離子模式下，所有化合物均在酰胺基團(tuán)附近發(fā)生裂解?；衔?和6分別為線性和支鏈結(jié)構(gòu)，且在化合物6的裂解過程中，支鏈末端依次丟失氨基(m/z514)、甲氨基(m/z499)和乙氨基(m/z485)，可作為區(qū)分二者的差異離子?；衔?4、15、16均為環(huán)八肽類結(jié)構(gòu)，中心環(huán)肽結(jié)構(gòu)通過色氨酸吲哚氮原子與甘氨酸的α碳原子以σ鍵關(guān)環(huán)形成，三肽支鏈通過甘氨酸氨基與中心環(huán)肽連接。通過分析質(zhì)譜碎裂途徑，發(fā)現(xiàn)支鏈與中心環(huán)連接的部位最容易斷裂，如化合物14和15的m/z501離子，以及化合物16的m/z527離子，均為中心五肽環(huán)的碎片離子。

圖2 寧夏枸杞根皮中有機(jī)酸及酯類化合物Fig.2 Organic acids and esters in the root bark of Lycium barbarum L.

2.1.3其他類型化學(xué)成分 參考文獻(xiàn)[17]報(bào)道的枸杞干燥根皮來源的地骨皮成分，發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞根皮存在一些其他結(jié)構(gòu)類型的物質(zhì)，如香豆素苷(17)、蒽醌苷(18)、木脂素苷(19)、綠原酸(20)和簡單香豆素(21)，示于圖4。在二級質(zhì)譜圖中，都具有糖基特征離子(m/z161或163)或糖基的中性丟失(-162 u)，可據(jù)此確定結(jié)構(gòu)中存在六碳糖基。如化合物19的母離子失去162 u得到苷元離子m/z359，為失去葡萄糖基的特征裂解。對化合物21進(jìn)行MS2分析，得到二級碎片離子m/z133、105和77，可能是其準(zhǔn)分子離子依次失去1個(gè)CO分子形成的。

2.2 分子網(wǎng)絡(luò)化分析

利用分子網(wǎng)絡(luò)化技術(shù)對寧夏枸杞根皮50%甲醇水洗脫液在負(fù)離子模式下m/z100～300和300～2 000范圍的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果示于圖5。由化合物2、22、23組成的子集表明，化合物22、23為化合物2的結(jié)構(gòu)類似物，根據(jù)二者的二級質(zhì)譜圖推測其結(jié)構(gòu)示于圖6。化合物14和15為早期從地骨皮中發(fā)現(xiàn)的環(huán)八肽類化合物，其準(zhǔn)分子離子分別為m/z872.3和895.3?；衔?4的準(zhǔn)分子離子為m/z1 035.4，與化合物14具有多個(gè)相同的碎片離子，在網(wǎng)絡(luò)中具有相關(guān)性，提示二者可能具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。與化合物14中心環(huán)的特征碎片離子m/z501、471、454相比，化合物24的特征碎片離子為m/z664、634、617，分別增加了163 u。而且化合物24的準(zhǔn)分子離子(m/z1 035.4[M + H]+)與其碎片離子m/z664之間的差值(Δ371 u)等于化合物14的支鏈質(zhì)量，表明化合物24與14具有相同的支鏈。因此，化合物24比14多的163 u只可能發(fā)生在中心環(huán)上，且為化合物14中心環(huán)插入1個(gè)酪氨酸。結(jié)合環(huán)肽類化合物16的裂解過程(圖3)，推測化合物24的斷裂位點(diǎn)也是以酰胺鍵裂解為主，通過分析碎片離子特征，確定酪氨酸殘基位于色氨酸與蘇氨酸之間。與化合物14相比，化合物24在氨基酸環(huán)上增加了1個(gè)酪氨酸，由環(huán)八肽變?yōu)榄h(huán)九肽。同樣，化合物25(分子離子峰為m/z1 058.4)與化合物15具有相關(guān)性，表明二者可能為結(jié)構(gòu)類似物，進(jìn)而可以確定化合物25的化學(xué)結(jié)構(gòu)。化合物26～30與GNPS數(shù)據(jù)庫收錄的化合物一致。

在由99個(gè)離子組成的子集中，化合物5或(和)6的準(zhǔn)分子離子為m/z529.1，由于缺乏已知化合物對比，目前無法解析；化合物19(m/z521.3)、31(m/z581.2)、32(m/z683.2)具有直接相關(guān)性，表明三者具有相似結(jié)構(gòu)，化合物31的準(zhǔn)分子離子比化合物19的大60 u，推測化合物31可能比化合物19多2個(gè)甲氧基。化合物32的準(zhǔn)分子離子比化合物19的大162 u，可能為六碳糖基，推測化合物31和32的結(jié)構(gòu)分別為Lyciumboside A和Lyciumboside B?；衔?4、25、31和32均為首次從地骨皮中發(fā)現(xiàn)的新結(jié)構(gòu)，且24和25可能為寧夏枸杞根皮中特有的環(huán)九肽類成分。

圖3 寧夏枸杞根皮中含氮化合物Fig.3 Known nitrogenous compounds in the root bark of Lycium barbarum L.

圖4 寧夏枸杞根皮中其他類型化合物Fig.4 Other compounds in the root bark of Lycium barbarum L.

圖6 通過網(wǎng)絡(luò)化聚類分析發(fā)現(xiàn)的化合物結(jié)構(gòu)Fig.6 Identified chemical structures by molecular networking analysis

3 結(jié)論

本研究利用HPLC-Q-TOF MS技術(shù)分析寧夏枸杞根皮水提物，發(fā)現(xiàn)了21個(gè)已知化合物，與枸杞根皮具有相似的化學(xué)組成。借助分子網(wǎng)絡(luò)化技術(shù)在負(fù)離子模式下發(fā)現(xiàn)并解析了11個(gè)化合物，均為首次在地骨皮中報(bào)道，其中化合物24和25為首次在地骨皮中檢測到的環(huán)九肽類成分，為進(jìn)一步研究地骨皮中環(huán)肽類化學(xué)成分生物合成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。該方法快速、簡便、準(zhǔn)確、消耗樣品少，為解析中草藥微量成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)提供了思路。

致謝：感謝中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院、甘肅省油氣資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的房嬛研究員和陳永欣副研究員提供的質(zhì)譜測試工作；感謝北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院任玉峰教授提供的物種鑒定工作。