許 霞，張晨傲，孫梓懿，鄭 珍，李功玉,3

(1.南開(kāi)大學(xué)化學(xué)學(xué)院，分析科學(xué)研究中心，天津市生物傳感與分子識(shí)別重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津 300070；3.物質(zhì)綠色創(chuàng)造與制造海河實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

非變性條件下的蛋白質(zhì)研究可以提供更具生物學(xué)意義的結(jié)構(gòu)信息，為蛋白質(zhì)“序列-結(jié)構(gòu)-功能”關(guān)系提供分子基礎(chǔ)，以此揭示標(biāo)志物蛋白在人類疾病發(fā)展過(guò)程中的作用，從而為疾病的精準(zhǔn)治療提供潛在的藥物靶點(diǎn)。非變性質(zhì)譜興起于20世紀(jì)90年代[1-3]，是一種使用特殊緩沖溶液(主要為醋酸銨)的蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)。自2004年Leney等[4]首次提出非變性質(zhì)譜(native mass spectrometry)概念至今，其已廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、質(zhì)譜分析、生物制藥等領(lǐng)域，且起著不可替代的作用。

如何在分析蛋白質(zhì)時(shí)使其保持近似自然生理環(huán)境中的非變性狀態(tài)，一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。與X射線衍射晶體學(xué)、冷凍電鏡等傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段相比，非變性質(zhì)譜受益于質(zhì)譜對(duì)分子質(zhì)量的高分辨檢測(cè)，其可在使用極少量蛋白非結(jié)晶樣品的前提下，以超快的分析速度提供蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合計(jì)量學(xué)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等信息。非變性質(zhì)譜與離子淌度儀(ion mobility spectrometry)聯(lián)用可以快速分析蛋白質(zhì)的高級(jí)構(gòu)象，用于蛋白質(zhì)和多肽的自組裝路徑解析追蹤與纖維化異質(zhì)性分析等研究[5]。

非變性質(zhì)譜分析時(shí)要求蛋白質(zhì)盡量維持或者接近天然生理環(huán)境中的狀態(tài)。因此，與傳統(tǒng)的變性蛋白質(zhì)質(zhì)譜相比，非變性質(zhì)譜可以在提供完整蛋白質(zhì)分子質(zhì)量信息的基礎(chǔ)上，盡可能保存非共價(jià)相互作用和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等信息。非變性質(zhì)譜要得到具有生物學(xué)意義的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，需至少滿足3個(gè)條件：1) 樣品制備條件溫和。在蛋白質(zhì)離子化之前，盡可能通過(guò)控制溶液條件，如pH值、離子強(qiáng)度、緩沖液組成等參數(shù)，使處于非變性溶液中的蛋白質(zhì)維持與正常生理?xiàng)l件下相近的折疊狀態(tài)[4,6]；2) 離子源條件溫和。蛋白質(zhì)分子在離子化、相轉(zhuǎn)換過(guò)程中，需使用溫和的離子源種類，選取合適的離子化參數(shù)，盡可能維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)；3) 質(zhì)譜儀條件溫和。非變性條件下生成的蛋白質(zhì)離子在儀器內(nèi)部傳輸、分離和檢測(cè)過(guò)程中，需要盡量減少高真空環(huán)境對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞作用，如使用低電壓模式并減少采樣時(shí)間。

本文將從蛋白提取、離子源開(kāi)發(fā)以及蛋白構(gòu)象解析新策略等3個(gè)方面，總結(jié)非變性結(jié)構(gòu)質(zhì)譜的研究現(xiàn)狀，并從化學(xué)測(cè)量學(xué)角度展望非變性結(jié)構(gòu)質(zhì)譜的發(fā)展前景。

1 非變性質(zhì)譜蛋白提取方法

1.1 傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)提取方法

蛋白質(zhì)提取是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的第一步，也是決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析成敗的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)提取包括總蛋白提取、膜蛋白提取、細(xì)胞核蛋白提取等方面，基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的帶電性、極性和親疏水性等差異，設(shè)計(jì)特異性識(shí)別探針或色譜柱進(jìn)行提取、富集與分離。目前常用的蛋白質(zhì)純化方法有超速離心法、選擇性沉淀法、凝膠層析法和親和層析法等[7-8]，示于圖1a～1d。值得注意的是，對(duì)提取純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析前，需要交換到合適的緩沖溶液中(如一系列濃度梯度的醋酸銨溶液)，使蛋白質(zhì)恢復(fù)到非變性狀態(tài)。

1.2 基于萃取技術(shù)的蛋白提取方法

樣品預(yù)處理對(duì)于非變性質(zhì)譜來(lái)說(shuō)十分重要，良好的樣品預(yù)處理既可以維持蛋白質(zhì)復(fù)合物內(nèi)的非共價(jià)相互作用，又可以保持樣品溶液與質(zhì)譜分析的兼容性，提高離子化效率。為了有效地從細(xì)胞、組織或血液中提取完整蛋白質(zhì)，通常會(huì)將表面活性劑加入緩沖液中，有利于提取常規(guī)方法不易得到的膜蛋白。由于傳統(tǒng)的離子型表面活性劑會(huì)在離子化過(guò)程中產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)，極大地抑制蛋白質(zhì)質(zhì)譜信號(hào)，因此離子型表面活性劑的去除對(duì)于這些蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)譜分析至關(guān)重要。但傳統(tǒng)的去除表面活性劑的方法往往不可避免地使蛋白質(zhì)遭受損失甚至降解，制約了蛋白質(zhì)提取效率的進(jìn)一步提升。美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校Ge課題組[9]近年來(lái)開(kāi)發(fā)了一種質(zhì)譜兼容的光裂解陰離子表面活性劑——4-己基苯基偶氮磺酸鹽，其能有效溶解蛋白質(zhì)，蛋白提取性能與十二烷基硫酸鈉(SDS)相當(dāng)。同時(shí)，該表面活性劑可以通過(guò)紫外線照射快速降解，不會(huì)影響質(zhì)譜檢測(cè)，可用于自上而下的完整蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

注：a.超速離心法；b.選擇性沉淀法；c.凝膠層析法；d.親和層析法；e.液體表面萃取[14]；f.納升解吸附電噴霧[14]；g.原位細(xì)胞蛋白提取質(zhì)譜[13]圖1 適用于結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析的蛋白提取純化方法Fig.1 Native MS-compatible protein extraction and purification methods

除離線的蛋白質(zhì)萃取提取方法，伯明翰大學(xué)Cooper課題組[10]利用液體表面萃取技術(shù)(liquid extraction surface analysis, LESA)從固體表面直接提取蛋白質(zhì)復(fù)合物用于在線質(zhì)譜分析，成功檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的親和素四聚體(～64 ku)、二硫化碳水解酶的八聚體(～190 ku)和十六聚體(～380 ku)、GroEL四聚體(～800 ku)以及AmtB膜蛋白三聚體等蛋白質(zhì)復(fù)合物，證明該萃取方法具有較廣泛的適用性，示于圖1e。該課題組于2022年報(bào)道了一種納升解吸附電噴霧離子源(nano-desorption electrospray ionization, nanoDESI)，通過(guò)表面蛋白萃取，初步實(shí)現(xiàn)了約200 μm空間分辨率的原位蛋白質(zhì)及其復(fù)合物成像分析，示于圖1f[11]。

1.3 原位蛋白分析

原位蛋白分析是指直接或僅需簡(jiǎn)單處理后即可對(duì)細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)分析的策略，其不需要嚴(yán)格的蛋白質(zhì)提取和樣本制備過(guò)程，簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)提取處理步驟，作為一種新的蛋白分析方法逐漸受到關(guān)注。2016年，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)Huang課題組[12]提出了一種原位質(zhì)譜分析策略，可以直接識(shí)別活細(xì)胞內(nèi)分子質(zhì)量相對(duì)較小的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-金屬離子復(fù)合物。有趣的是，該課題組在這項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的工作中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)外金屬蛋白與金屬離子結(jié)合狀態(tài)的顯著差異。然而，由于配體、溶劑和其他細(xì)胞成分的大量非特異性結(jié)合，直接在細(xì)胞中識(shí)別更大的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)/配體復(fù)合物仍然具有挑戰(zhàn)性。隨后，該課題組又提出了一種通用的一步質(zhì)譜策略[13]，命名為“活細(xì)胞質(zhì)譜”(In-cell MS)，該技術(shù)可用于直接從活細(xì)胞進(jìn)行原位蛋白提取，并在毫秒級(jí)時(shí)間之后對(duì)提取的蛋白質(zhì)及其復(fù)合物進(jìn)行在線、實(shí)時(shí)鑒定和相互作用監(jiān)測(cè)。作者利用該策略成功實(shí)現(xiàn)了分子質(zhì)量4～44 ku的17種蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的原位檢測(cè)，示于圖1g。與此同時(shí)，Cooper課題組[11]利用LESA和nanoDESI技術(shù)從腦、腎、肝等組織中直接鑒定了8種內(nèi)源蛋白質(zhì)聚集體，成功表征了亞基組成化學(xué)計(jì)量學(xué)等信息，并實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)復(fù)合物在非變性質(zhì)譜條件下的初步成像分析。這些研究表明，原位質(zhì)譜技術(shù)可以最大程度地還原細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的真實(shí)生理狀態(tài)，有助于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究。

2 非變性質(zhì)譜的蛋白質(zhì)離子化方法

2.1 傳統(tǒng)蛋白質(zhì)質(zhì)譜離子源

目前，生物質(zhì)譜分析常用的2種主要離子源是電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸離子源(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)。由于在MALDI基質(zhì)中(通常是酸性和變性環(huán)境)保存大分子復(fù)合物并維持非變性結(jié)構(gòu)的難度較大，其在非變性結(jié)構(gòu)質(zhì)譜領(lǐng)域的應(yīng)用較少[15-16]。而ESI不需要使用額外基質(zhì)，也可以不加激光和熱量等，是目前最溫和的離子源，也是非變性結(jié)構(gòu)質(zhì)譜的首選離子源。

在滿足蛋白質(zhì)非變性構(gòu)象與四級(jí)結(jié)構(gòu)兼容的條件下，ESI仍受到靈敏度和樣品利用率等方面的制約。在傳統(tǒng)ESI中，溶液流速較快(>1 μL/min)，管噴嘴直徑較大，以致產(chǎn)生的初始液滴尺寸較大(往往大于25 μm)，需要噴嘴與取樣口之間有足夠長(zhǎng)的距離以支持液滴完成向氣相離子的演化[17]，形成的氣相離子僅有少部分進(jìn)入質(zhì)譜被檢測(cè)，導(dǎo)致浪費(fèi)大量樣品的同時(shí)，很多低豐度的蛋白質(zhì)分子離子也在這一過(guò)程中丟失，使靈敏度降低。相比于常規(guī)電噴霧，納升電噴霧(nanoelectrospray ionization, nESI)使用更小內(nèi)徑的噴針毛細(xì)管(1～5 μm)，噴霧流速可降至100 nL/min[18]，由此產(chǎn)生的液滴尺寸較小，離子化效率較高，一定程度上解決了離子抑制效應(yīng)的問(wèn)題，更有利于分析蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，nESI是目前非變性質(zhì)譜領(lǐng)域最常用的離子化方法[4]。

2.2 新型高性能結(jié)構(gòu)質(zhì)譜離子源

在非變性質(zhì)譜分析時(shí)，通常通過(guò)添加非揮發(fā)性高鹽溶液的方式模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，并穩(wěn)定蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的天然結(jié)構(gòu)，維持蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-配體、酶-輔助因子的相互作用[19]。然而，復(fù)雜樣品帶來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)會(huì)干擾分析物的質(zhì)譜檢測(cè)，產(chǎn)生離子抑制現(xiàn)象[20-22]，同時(shí)增加基線噪音，導(dǎo)致靈敏度顯著降低[23]；難揮發(fā)鹽會(huì)與蛋白質(zhì)離子形成加合物，多種蛋白質(zhì)-鹽加合離子的產(chǎn)生使質(zhì)譜信號(hào)分布變寬，蛋白質(zhì)信號(hào)分布到多個(gè)離子峰上，降低了蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的信號(hào)強(qiáng)度、質(zhì)量測(cè)量的準(zhǔn)確性以及檢測(cè)復(fù)合物中質(zhì)量相近蛋白質(zhì)翻譯后修飾的能力[19]。為減少?gòu)?fù)雜樣品分析時(shí)的離子抑制干擾，通常在非變性質(zhì)譜分析前使用透析[24]、滲濾[25]、離子色譜[23]、液相色譜[26-29]、毛細(xì)管電泳[30-34]或固相微萃取[35-36]等方法離線去除非揮發(fā)性鹽，提高質(zhì)譜分析的靈敏度，減少基質(zhì)干擾。但該過(guò)程相對(duì)繁瑣，分離過(guò)程中對(duì)樣品的稀釋也使其不適合分析信號(hào)強(qiáng)度較低的樣品，且對(duì)于離子色譜而言，蛋白質(zhì)分析物與色譜柱之間的相互作用可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。因此，近年來(lái)一些實(shí)驗(yàn)室在納升電噴霧的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，取得了一系列重要進(jìn)展。

2.2.1感應(yīng)納升電噴霧 美國(guó)普渡大學(xué)Cooks課題組[37]開(kāi)發(fā)的感應(yīng)納升電噴霧離子化(induced nanoESI, InESI)為蛋白質(zhì)等生物大分子的高通量測(cè)定提供了新方法。它不僅減弱了基質(zhì)效應(yīng)，而且避免了電極和噴霧溶劑之間的物理接觸，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的高效檢出。感應(yīng)納升電噴霧裝置在噴霧毛細(xì)管外放置一平面電極并施加交流電，利用其誘導(dǎo)產(chǎn)生的感應(yīng)電場(chǎng)產(chǎn)生溶液噴霧將分析物離子化，示于圖2a。所施加的交流電可以使InESI中的溶液噴霧交替生成正、負(fù)離子，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)有較強(qiáng)的耐受性，電離效率高，噴霧毛細(xì)管不易堵塞，可以在沒(méi)有任何預(yù)處理的情況下分析蛋白質(zhì)樣品，使復(fù)雜樣品的高通量分析成為可能[38]。

2.2.2梯度電壓納升電噴霧 清華大學(xué)Zhang課題組[39]提出的梯度電壓納升電噴霧(step-voltage nano electrospray ionization method, SV-nano-ESI)可顯著消除微量樣品分析中的基質(zhì)干擾，示于圖2b。在發(fā)射器的尖端區(qū)域，可通過(guò)離子電遷移實(shí)現(xiàn)分析物和基質(zhì)之間的有效分離。在2.4 kV電壓下分析樣品，強(qiáng)電場(chǎng)使基質(zhì)中的陽(yáng)離子與陰離子在尖端區(qū)迅速向相反方向遷移形成前導(dǎo)帶和拖尾帶，由于目標(biāo)蛋白質(zhì)具有較低的電遷移率，幾乎保持在中間條帶，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物在不受基質(zhì)干擾的情況下獲得較高的信噪比。SV-nano-ESI施加在噴霧毛細(xì)管上的高壓是去除基質(zhì)的關(guān)鍵因素，該電壓必須高于發(fā)生分離的臨界電壓，基質(zhì)去除率與高電壓的持續(xù)時(shí)間(即放電時(shí)間)高度相關(guān)。因此，通過(guò)控制電壓與放電時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分析物與復(fù)雜基質(zhì)的分離。SV-nano-ESI將分離過(guò)程與離子化過(guò)程相結(jié)合，不需預(yù)處理即可實(shí)現(xiàn)微量樣品的高通量快速分析。

注：a,b.感應(yīng)納升電噴霧電離[38]與梯度電壓納升電噴霧法[39]裝置示意圖(改變對(duì)nESI的施加電壓)；c.亞微米噴針的脫鹽效應(yīng)[19](減小nESI尖端尺寸)；d.紙噴霧離子化法[62]圖2 新型非變性結(jié)構(gòu)質(zhì)譜離子源Fig.2 Emerging ion sources for native mass spectrometry

2.2.3亞微米電噴霧 加州大學(xué)伯克利分校Williams課題組[19]使用尺寸更小的噴霧毛細(xì)管尖端，即亞微米電噴霧，更好地分辨了蛋白質(zhì)的電荷態(tài)分布，降低了鹽加合離子峰的豐度，示于圖2c。相較于尖端直徑大于1 μm的傳統(tǒng)噴針，尖端直徑0.5 μm的亞微米噴針在電噴霧過(guò)程中產(chǎn)生的初始液滴更小，含有的蛋白質(zhì)數(shù)目不多于1個(gè)。他們發(fā)現(xiàn)液滴中含有的鹽離子隨液滴尺寸的縮小而減少，當(dāng)液滴含有少于1個(gè)蛋白質(zhì)分子時(shí)，每個(gè)含有蛋白質(zhì)分子的液滴中鹽與蛋白質(zhì)的比例降低，大部分鹽離子被包裹在不包含蛋白質(zhì)分子的液滴中。通過(guò)產(chǎn)生低鹽含量的初始液滴和在尖端處施加高強(qiáng)度電場(chǎng)，亞微米噴針可降低鹽離子的加合，直接從各種常用的高濃度非揮發(fā)性鹽緩沖液中分析蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物，節(jié)省了離線脫鹽等樣品預(yù)處理步驟。普渡大學(xué)Cooks課題組和新罕布什爾大學(xué)Li課題組[40-41]使用亞微米噴針?lè)謩e開(kāi)發(fā)了流速低至pL/min和fL/min(<10 pL/min)的電噴霧離子化方法。

2.2.4解吸電噴霧 普渡大學(xué)Cooks課題組[42-43]開(kāi)發(fā)的解吸電噴霧離子源(desorption electrospray ionization, DESI)技術(shù)無(wú)需樣品前處理和預(yù)分離即可實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜采樣分析。 DESI實(shí)驗(yàn)中，表面分子的提取和去溶劑化的時(shí)間極短，在小分子分析領(lǐng)域取得了較廣泛的應(yīng)用，但由于萃取效率等原因，在復(fù)雜表面提取蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析的應(yīng)用較少。2017年，劍橋大學(xué)Robinson課題組[44]通過(guò)移除離子轉(zhuǎn)移管使DESI可直接定位于質(zhì)譜采樣錐下方，完成了第一個(gè)完整蛋白質(zhì)復(fù)合物的DESI分析，初步嘗試了DESI針對(duì)水溶性蛋白和膜蛋白及其復(fù)合物的天然結(jié)構(gòu)分析方面的應(yīng)用。隨后，帝國(guó)理工大學(xué)Bunch課題組[45]使用DESI檢測(cè)出了完整的血紅蛋白。

在傳統(tǒng)DESI實(shí)驗(yàn)中，液滴和氣體會(huì)與樣品發(fā)生碰撞，利用溶劑與分析物的濺射實(shí)現(xiàn)離子解吸附，但不定向的濺射會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)效率降低。因此，Laskin課題組[46]提出了nanoDESI技術(shù)，使用自吸毛細(xì)管替代原有的氣路輔助解吸方法，有效消除離子飛濺，提高采樣效率。

2.3 非變性高氣壓電噴霧產(chǎn)生超電荷離子

由于大部分質(zhì)量分析器對(duì)質(zhì)荷比響應(yīng)靈敏度呈指數(shù)級(jí)反比關(guān)系，因此提高蛋白質(zhì)分析物的電荷態(tài)可以提升質(zhì)量分析器的檢測(cè)效率[47]，加深對(duì)非變性蛋白質(zhì)離子氣相結(jié)構(gòu)的理解，優(yōu)化基于電子或碰撞的離子活化方法中的解離效率、碎片離子數(shù)、序列覆蓋率等[48-50]信息。電噴霧中高壓氣流的引入可以產(chǎn)生極微小的噴霧液滴[51]，不僅可以提高樣品的除鹽效果，從總體上增加信號(hào)強(qiáng)度[52-55]，而且可以增加高電荷態(tài)離子的信號(hào)強(qiáng)度[56]，提高蛋白質(zhì)離子的電荷態(tài)。中山大學(xué)Li課題組[57]應(yīng)用這一原理，使用高氣壓電噴霧(high-pressure ESI)產(chǎn)生了最高電荷態(tài)超過(guò)瑞利極限的超電荷離子。通過(guò)非變性質(zhì)譜和離子淌度碰撞截面積(collision cross-section, CCS)測(cè)定，證實(shí)高氣壓電噴霧在蛋白結(jié)構(gòu)分析時(shí)的優(yōu)勢(shì)。與固定電荷基團(tuán)化學(xué)衍生化[58]、亞微米噴射尖端[59]、超電荷試劑[60-61]等提高電荷態(tài)的方法相比，高氣壓電噴霧是一種快捷簡(jiǎn)單且可控的超電荷方法。

2.4 紙噴霧用于非共價(jià)蛋白質(zhì)復(fù)合物離子化

紙噴霧離子化(paper spray ionization, PS)是2010年由普渡大學(xué)Cooks課題組提出[62]，是一種迅速直接的敞開(kāi)式離子化方法，兼具ESI與敞開(kāi)式離子化方法的特點(diǎn)，其原理是將樣品溶液點(diǎn)樣于紙上，然后對(duì)濕潤(rùn)的紙張施加高電壓產(chǎn)生離子，示于圖2d。俄亥俄州立大學(xué)Wysocki課題組[63]將PS應(yīng)用于非共價(jià)蛋白復(fù)合物的質(zhì)譜分析，觀察到PS產(chǎn)生了與nESI相似的質(zhì)譜圖，初步表明其可以保存蛋白質(zhì)分析物中的非共價(jià)作用；進(jìn)一步的離子淌度質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)提供的CCS數(shù)據(jù)也證明了其非變性質(zhì)譜的兼容性，表明PS具有作為蛋白復(fù)合物非變性質(zhì)譜分析離子化方法的潛力。

3 蛋白質(zhì)構(gòu)象的結(jié)構(gòu)質(zhì)譜解析

3.1 基于離子淌度質(zhì)譜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法

離子淌度質(zhì)譜(ion mobility-mass spectrometry, IM-MS)整合了離子淌度儀對(duì)離子進(jìn)行尺寸和形貌分離以及質(zhì)譜對(duì)分子質(zhì)量和電荷進(jìn)行分離的優(yōu)勢(shì)，根據(jù)離子淌度儀中離子漂移時(shí)間的長(zhǎng)短區(qū)分不同離子，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)相同質(zhì)荷比(m/z)離子的二維構(gòu)象分離分析。通過(guò)整合漂移時(shí)間與物理模型可計(jì)算蛋白質(zhì)離子的CCS，用于定量描述蛋白質(zhì)離子的大小與形狀。離子淌度與質(zhì)譜的聯(lián)用使蛋白質(zhì)離子的分析增加了反映離子尺寸與形狀的CCS這一維度，實(shí)現(xiàn)在相同m/z下分辨同一蛋白質(zhì)離子的不同折疊狀態(tài)、蛋白質(zhì)聚集體的不同聚集狀態(tài)等，提供了更豐富的氣相蛋白質(zhì)離子結(jié)構(gòu)信息。

非變性離子淌度質(zhì)譜呈現(xiàn)的是蛋白質(zhì)離子的靜態(tài)構(gòu)象信息。受限于儀器分辨率，蛋白質(zhì)的微小差異構(gòu)象在多種商業(yè)化儀器上往往無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效分辨。鑒于此，開(kāi)發(fā)了一種動(dòng)態(tài)蛋白構(gòu)象分析方法——碰撞誘導(dǎo)去折疊(collision-induced unfolding, CIU)，即在離子淌度分析器前增加碰撞激發(fā)池，在電場(chǎng)加速作用下，蛋白質(zhì)離子在碰撞激發(fā)池與惰性氣體發(fā)生碰撞，蛋白質(zhì)的動(dòng)能轉(zhuǎn)化為內(nèi)能而被激發(fā)，進(jìn)而被誘導(dǎo)發(fā)生構(gòu)象去折疊過(guò)程。這種去折疊引起的構(gòu)象變化可以用CCS表征，通過(guò)逐步提高碰撞能量，蛋白質(zhì)不斷去折疊，CCS逐步增大，結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)離子會(huì)出現(xiàn)不同的特征去折疊反應(yīng)路徑，原本通過(guò)CCS無(wú)法區(qū)分的蛋白質(zhì)構(gòu)象，通過(guò)不同CIU路徑可以進(jìn)行有效分辨。因此，與單獨(dú)CCS測(cè)量相比，基于CIU的非變性離子淌度結(jié)構(gòu)質(zhì)譜在具備捕獲蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)能力的同時(shí)，還展示出更高的結(jié)構(gòu)分辨率，可以用來(lái)比較特定殘基、結(jié)構(gòu)域和翻譯后修飾對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響[64-66]、評(píng)價(jià)特定蛋白質(zhì)靶向的配體分子結(jié)合效果以開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)篩選工具[67]。

然而，由于電噴霧產(chǎn)生的蛋白質(zhì)離子不可避免地存在一定寬度的電荷態(tài)分布[68-69]，傳統(tǒng)的CIU在實(shí)際操作過(guò)程中為簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)分析，常依賴于四極桿篩選，對(duì)單一電荷態(tài)離子進(jìn)行分析。值得注意的是，一方面，溶液相的電荷態(tài)和氣相的電荷態(tài)之間的關(guān)聯(lián)性并不強(qiáng)；另一方面，不同電荷態(tài)的蛋白質(zhì)離子往往會(huì)產(chǎn)生不同的去折疊路徑，表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)信息，所選取的單一電荷態(tài)并不一定能反映溶液相非變性結(jié)構(gòu)信息。由于目前預(yù)測(cè)具有最接近非變性狀態(tài)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)離子電荷態(tài)仍存在困難，任意指定單一電荷態(tài)離子的分析不可避免地會(huì)產(chǎn)生電荷偏差效應(yīng)。綜上，選擇單一電荷態(tài)的CIU構(gòu)象分析策略不能全面提供溶液相蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，為避免單一電荷態(tài)的電荷偏差效應(yīng)，需要付出更多的時(shí)間成本以篩選目標(biāo)電荷態(tài)或逐個(gè)收集所有電荷態(tài)的數(shù)據(jù)。因此，本課題組[70]提出一種針對(duì)CIU策略的改進(jìn)方案，即非靶向構(gòu)象解析，包含全離子構(gòu)象去折疊技術(shù)(all ion unfolding, AIU)和全構(gòu)象表征方案(CCS accumulation, CCSacc)。

圖3 非靶向構(gòu)象解析策略示意圖[70]Fig.3 Schematic illustration of non-targeted conformational interrogation strategy[70]

非靶向構(gòu)象快速、高通量解析的示意圖示于圖3，對(duì)比性地闡述了CIU與AIU數(shù)據(jù)采集及其可視化方式的差異流程圖。其中，AIU技術(shù)不再依賴前級(jí)四極桿篩選離子，而是將所有的蛋白質(zhì)離子全部引入碰撞池進(jìn)行構(gòu)象去折疊操控，并利用離子淌度質(zhì)譜追蹤所有電荷態(tài)下的去折疊路徑。為進(jìn)一步消除電荷偏差效應(yīng)，在引入AIU操控技術(shù)的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了一個(gè)全新的全構(gòu)象表征參數(shù)CCSacc，即通過(guò)將不同電荷態(tài)離子的CCS按相對(duì)豐度累積，考慮不同電荷態(tài)下的構(gòu)象貢獻(xiàn)，組成一個(gè)能代表蛋白質(zhì)全局結(jié)構(gòu)的構(gòu)象參數(shù)CCSacc。AIU技術(shù)與CCSacc全局構(gòu)象表征的有機(jī)結(jié)合，助力蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)質(zhì)譜分析從傳統(tǒng)的低通量靶向分析發(fā)展成為新型的高通量非靶向構(gòu)象解析。這種新型的非靶向構(gòu)象分析不僅保留了每個(gè)電荷態(tài)所攜帶的靜態(tài)構(gòu)象及其動(dòng)態(tài)變化信息，而且能夠更全面地揭示從溶液到氣相中所有蛋白的全局結(jié)構(gòu)信息。數(shù)據(jù)證明，這種方法受ESI產(chǎn)生的電荷態(tài)分布變化影響更小，對(duì)于結(jié)構(gòu)相似蛋白質(zhì)，非靶向方法更能表征出其中的細(xì)微結(jié)構(gòu)差異。非靶向的構(gòu)象解析技術(shù)已經(jīng)被用于蛋白質(zhì)種屬差異鑒定[70]和低豐度不穩(wěn)定翻譯后修飾的構(gòu)效關(guān)系[71]，并有望用于更多蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比性研究。

3.2 溶液相構(gòu)象分析手段——離子遷移電泳法

與上述氣相分析方法相比，溶液相的構(gòu)象分析方法是一種更直接表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的手段，可以提供更真實(shí)可信的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，獲取與非變性質(zhì)譜相對(duì)應(yīng)的構(gòu)象信息，二者相互印證。北京理工大學(xué)Xu課題組[72-75]基于傳統(tǒng)電泳技術(shù)開(kāi)發(fā)出全新的溶液相離子遷移電泳(mobility capillary electrophoresis, MCE)策略，嘗試建立溶液相與氣相蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)。MCE保留了傳統(tǒng)電泳方法的分離電場(chǎng)，具有一定的復(fù)雜樣品分離能力，可以通過(guò)蛋白質(zhì)離子的保留時(shí)間測(cè)定其等效帶電量。在此基礎(chǔ)上，MCE使用Laminar流取代傳統(tǒng)電泳的電滲流，實(shí)現(xiàn)了高穩(wěn)定性、精準(zhǔn)可控的離子遷移；泰勒擴(kuò)散分析的引入使蛋白質(zhì)離子流體動(dòng)力學(xué)半徑的測(cè)定可以通過(guò)峰形分析實(shí)現(xiàn)。綜上，MCE同時(shí)實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜組分分離、離子等效帶電量測(cè)定與離子流體動(dòng)力學(xué)半徑測(cè)定，但這些信息仍然無(wú)法反映蛋白質(zhì)的立體形貌。

MCE與非變性質(zhì)譜聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)橢球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的初步確定，示于圖4[76-77]。通過(guò)對(duì)橢球狀蛋白質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單建模可知，確定其三維形狀即確定橢球的半徑(a、b、c)；蛋白質(zhì)離子在非變性質(zhì)譜中表現(xiàn)出的電荷態(tài)分布反映了溶劑可及表面積(solvent accessible surface area, SASA)的大小，包含了半徑a的信息；MCE實(shí)驗(yàn)提供的流體動(dòng)力學(xué)半徑Rh與蛋白質(zhì)體積V可以確定半徑b、c。綜上，MCE與非變性質(zhì)譜聯(lián)用可以確定溶液相蛋白質(zhì)離子的三維尺寸信息，以反映其折疊狀態(tài)等構(gòu)象信息。將上述設(shè)計(jì)成果應(yīng)用于一系列長(zhǎng)球狀、扁平狀蛋白質(zhì)良好的三維形狀測(cè)定，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)具有較好的一致性。

4 總結(jié)與展望

非變性質(zhì)譜的出現(xiàn)使通過(guò)質(zhì)譜手段在近似生理狀態(tài)下分析蛋白質(zhì)組成及變化成為現(xiàn)實(shí)，在蛋白質(zhì)翻譯后修飾、蛋白結(jié)構(gòu)與功能、蛋白質(zhì)非共價(jià)相互作用以及蛋白復(fù)合物的化學(xué)計(jì)量學(xué)研究中發(fā)揮著不可替代的作用。離子淌度技術(shù)的引入以及多種構(gòu)象分析手段的開(kāi)發(fā)使得非變性質(zhì)譜在蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析方面有了新的應(yīng)用前景，尤其是在局部細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)及分子模擬技術(shù)的融合策略下，非變性結(jié)構(gòu)質(zhì)譜技術(shù)可輔助構(gòu)建蛋白質(zhì)高精度三維結(jié)構(gòu)模型。

雖然非變性質(zhì)譜研究已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，結(jié)構(gòu)質(zhì)譜領(lǐng)域仍面臨挑戰(zhàn)：1) 局限于離線檢測(cè)，缺乏原位蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。如目前大多數(shù)非變性質(zhì)譜的分析對(duì)象都是重組蛋白或者表達(dá)純化后的蛋白復(fù)合物體系，然而重組蛋白脫離了蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的原有天然生物環(huán)境，缺少天然翻譯后修飾與伴侶分子，可能使相關(guān)結(jié)構(gòu)解析信息失真[5，78]。這一問(wèn)題的關(guān)鍵在于結(jié)構(gòu)質(zhì)譜環(huán)境兼容性，即質(zhì)譜檢測(cè)環(huán)境(要求中性、無(wú)非揮發(fā)性鹽的緩沖體系)與蛋白生存的生物環(huán)境(多種不同pH值條件、高鹽條件)之間的兼容性問(wèn)題，本質(zhì)原因在于結(jié)構(gòu)質(zhì)譜離子源的靈敏度不高。原位質(zhì)譜技術(shù)的開(kāi)發(fā)有望解決這一問(wèn)題，將對(duì)蛋白質(zhì)的分析從純品發(fā)展到細(xì)胞及局部組織環(huán)境水平。Sharon課題組[78-80]在內(nèi)源性蛋白復(fù)合物的非變性質(zhì)譜檢測(cè)方面做了重要工作。此外，馬斯特里赫特大學(xué)Heeren課題組[81]開(kāi)發(fā)的微通道板(microchannel plate)檢測(cè)器技術(shù)與近些年商業(yè)化的電荷探測(cè)質(zhì)譜(charge detection MS, CDMS)技術(shù)代表了結(jié)構(gòu)質(zhì)譜硬件的最新進(jìn)展[82-83]。隨著離子源和檢測(cè)方法的不斷提升和優(yōu)化，非變性質(zhì)譜技術(shù)將推動(dòng)蛋白質(zhì)功能性結(jié)構(gòu)原位分析的進(jìn)一步發(fā)展。2) 結(jié)構(gòu)分辨率無(wú)法匹配其他結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)。本文聚焦的基于離子淌度的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，目前折算的結(jié)構(gòu)分辨率上很難突破10埃，顯然無(wú)法滿足結(jié)構(gòu)生物學(xué)對(duì)于超高分辨的結(jié)構(gòu)解析需求。已有報(bào)道將離子淌度結(jié)構(gòu)質(zhì)譜與非變性結(jié)構(gòu)質(zhì)譜領(lǐng)域其他結(jié)構(gòu)表征手段如化學(xué)交聯(lián)[84]、氫氘交換以及分子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)相結(jié)合[85]，使結(jié)構(gòu)質(zhì)譜分辨率得到了有效提高，可以整合全局以及局部細(xì)節(jié)的結(jié)構(gòu)信息，構(gòu)建可靠的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)模型。當(dāng)然，結(jié)構(gòu)分辨率的提升最終還是依賴于提升儀器硬件性能及對(duì)應(yīng)的儀器應(yīng)用方法，包括新型構(gòu)象分辨離子淌度技術(shù)以及新型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)化學(xué)探針等[86-88]。

注：a.MCE同時(shí)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品分離、等效帶電量測(cè)定、流體動(dòng)力學(xué)半徑測(cè)定[72,74]；b.MCE與native MS聯(lián)用建立橢球狀蛋白三維模型流程[76]圖4 MCE測(cè)定蛋白結(jié)構(gòu)的工作流程Fig.4 Workflow of MCE-based protein structure probing