程麗芳 夏碧霞 何萍秀 吳憶

皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是起源于表皮形成細胞的惡性增殖，大多數(shù)發(fā)生在老年患者的曝光部位，是人類第二常見的癌癥，它的發(fā)病率還在持續(xù)上升[1]。由于其局部侵襲性強，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較高，對老年患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，而老年人特別是高齡老人全身情況較差，難以支持長時間手術(shù)，因此需要對cSCC 的分期和預(yù)后做早期診斷并需要除手術(shù)切除之外的多種方法治療[2]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock factor 1，HSF1）是一組普遍存在于真核生物細胞中調(diào)節(jié)熱休克反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，它的激活與腫瘤的起始、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移廣泛相關(guān)，已被證明是腫瘤啟動子和潛在的診斷標志物[3]，并與患者的預(yù)后有很強的相關(guān)性[4]。目前有HSF1 和乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥相關(guān)的研究報道，HSF1 在癌組織中的陽性表達率明顯高于對照組織，但尚無與皮膚鱗狀細胞癌的相關(guān)的研究[5-6]。本研究旨在通過檢測HSF1 在cSCC 中的表達來探索其與cSCC 分化和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年12 月-2021 年6 月江西省皮膚病?？漆t(yī)院病理科確診為cSCC 的42 例患者的癌組織標本蠟塊（高中低分化的比例為1∶1∶1，其中有轉(zhuǎn)移性cSCC 8 例），取該患者的癌旁組織標本作為對照；選取3 年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)的10 例cSCC 患者的標本蠟塊為復(fù)發(fā)組（高中低分化的比例為5∶4∶1）和隨訪3 年未發(fā)生復(fù)發(fā)的20 例cSCC 患者的標本蠟塊為未復(fù)發(fā)組（高中低分化的比例為5∶4∶1）。診斷標準參照《中國臨床皮膚病學(xué)》。納入標準：（1）資料完整且經(jīng)兩位病理科醫(yī)師雙盲法閱片同時確診為cSCC；（2）有充足的組織供研究。排除標準：術(shù)前未經(jīng)放療、化療或免疫療法。納入的42 例cSCC 患者中，男21例，女21 例；年齡44～96歲，平均（74.95±11.69）歲；分化程度：高分化14例，中分化14例，低分化14 例。本研究已經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 一抗（兔抗人HSF1 多克隆抗體BA1637）購自武漢博士德生物工程有限公司。二抗（HPR 標記鼠/兔通用型二抗）、檸檬酸抗原修復(fù)液購自福州邁新生物科技有限公司。PBS 緩沖液、DAB 顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 采用免疫組化EnVision 法染色 把切成4 μm的石蠟切片脫蠟水洗；滴加3% H2O2內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑作用8 min，PBS 水洗3 次（每次3 min）；檸檬酸修復(fù)液放置高壓鍋中加熱煮沸后取出，將切片置于其中直至冷卻，取出放置孵育盒中，滴加一抗（濃度為1∶400），放置4 ℃冰箱過夜；第二天取出用PBS 水洗3 次（每次3 min）；滴加二抗放置37 ℃水浴箱中孵育16 min，PBS 水洗3 次（每次 3 min）；DAB 顯色，時間1～3 min；蒸餾水沖洗；蘇木素復(fù)染10 s，鹽酸酒精分化2 s，自來水沖洗返藍，脫水（75%酒精、85%酒精、95%酒精，無水酒精水；二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3 各10 s）；中性樹膠封片。光鏡下觀察。

1.3 觀察指標及評價標準 分析HSF1 在cSCC 中的表達情況。分析HSF1 在cSCC 中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。分析HSF1 在復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)cSCC組織中的表達。結(jié)果判讀：HSF1 陽性表達為細胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒。由兩位資深病理醫(yī)師采用雙盲法進行判讀。染色強度打分：0 分未著色；1 分淺黃色，略高于背景；2 分棕黃色，明顯高于背景；3 分棕褐色。每張切片隨機選取5 個高倍鏡視野計數(shù)陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分，≤25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～70%為3 分；＞70%為4 分。將以上兩項結(jié)果的乘積分為4 級：0～2 分為陰性（-）；3、4 分為弱陽性（+）；5～8 分為陽性（++）；9～12 分為強陽性（+++）。其中陰性（-）和弱陽性（+）判定為低表達即陰性表達，陽性（++）和強陽性（+++）判定為高表達即陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，行Pearsonχ2檢驗和連續(xù)性校正χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSF1 在cSCC 組織中的表達 HSF1 陽性表達部位主要在細胞核，見圖1。cSCC 組織HSF1 表達陽性率為61.90%（26/42），高于對照組癌旁組織的0，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=37.655，P=0.000），見表1。

表1 HSF1在cSCC組織和癌旁組織表達[例（%）]

圖1 HSF1在cSCC中的表達情況

2.2 HSF1 在cSCC 中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同性別、年齡、皮損部位的cSCC 患者的HSF1陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤最大直徑＞2 cm 患者的HSF1 陽性表達率高于腫瘤最大直徑≤2 cm 患者（P＜0.05）。不同分化程度cSCC 患者的HSF1 陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。發(fā)生轉(zhuǎn)移的cSCC 患者的HSF1陽性表達率高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 HSF1表達與cSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例（%）]

2.3 HSF1 在復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)的cSCC 患者中的表達 復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)cSCC 患者的HSF1 陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.017，P=0.897），見表3。

表3 HSF1在復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)cSCC患者中表達[例（%）]

3 討論

惡性轉(zhuǎn)化伴隨著調(diào)節(jié)發(fā)育、代謝、增殖、運動及抗壓能力的關(guān)鍵細胞通路的改變，熱休克因子（HSFs）作為一種轉(zhuǎn)錄因子，已被證明在所有這些生物過程中發(fā)揮重要作用[7]。癌細胞長期暴露在各種壓力下，如缺氧和營養(yǎng)缺乏、免疫反應(yīng)、代謝失調(diào)和基因組不穩(wěn)定等，都會導(dǎo)致HSF1 的激活[8]。HSF1已被證明在許多癌細胞系、自發(fā)性腫瘤發(fā)生小鼠模型和移植瘤中促進癌癥的起始、維持和進展[9-10]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，HSF1 在多種腫瘤中過表達，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11-13]。遺傳毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和代謝等各種環(huán)境應(yīng)激原可誘導(dǎo)HSF1 過度激活和升高，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。目前已證實的HSF1 對腫瘤的作用及機制包括：（1）通過提高熱休克蛋白27（HSP27）、熱休克蛋白70（HSP70）和熱休克蛋白90（HSP90）的水平，調(diào)控Bag-3 輔助伴侶分子的表達和負調(diào)控促凋亡的X 連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子-1（XAF1）而在腫瘤細胞逃避程序性細胞死亡中起重要作用；（2）調(diào)節(jié)細胞周期進程和有絲分裂；（3）與細胞分裂周期蛋白20（CDC20）結(jié)合及阻斷CDC20 和細胞分裂周期蛋白27（CDC27）的相互作用來誘導(dǎo)非整倍體形成，而非整倍體常與細胞分化降低和腫瘤惡性程度增加有關(guān)；（4）癌細胞中HSF1 水平的升高可以調(diào)節(jié)能量代謝，將葡萄糖利用轉(zhuǎn)向糖酵解途徑，同時，可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，為腫瘤細胞的快速生長提供能量[15]；（5）調(diào)控和定義腫瘤起始細胞的表型；（6）改變局部組織環(huán)境以支持腫瘤發(fā)生，包括血管生成、侵襲或間質(zhì)激活；（7）HSF1 作為不同信號通路的調(diào)節(jié)劑參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如HuR-HIF-1、Slug、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）、PI3K-AKT-mTOR、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等通路[9]；（8）通過HSP 介導(dǎo)的下游效應(yīng)或其他新的轉(zhuǎn)錄靶點參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移；（9）促進腫瘤的復(fù)發(fā)和耐藥[16-17]；（10）HSF1 也以基因組的各種非編碼區(qū)域為目標，HSF1 直接結(jié)合的非編碼基因組位點，包括中心外衛(wèi)星DNA 重復(fù)序列、（亞）端粒DNA 重復(fù)序列、短間雜核元件重復(fù)序列、轉(zhuǎn)錄活性增強子等[18]。

HSF1 的激活受細胞內(nèi)多種分子和信號通路的調(diào)控，HSF1 的激活和衰減構(gòu)成了一個維持細胞蛋白質(zhì)穩(wěn)定的復(fù)雜循環(huán)，至少包括以下六個步驟：去抑制、三聚體化、核易位、DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活和調(diào)節(jié)HSF1 的穩(wěn)定性。大多數(shù)調(diào)控發(fā)生在翻譯后修飾水平，包括磷酸化、乙?；?、類泛素化和泛素化。除了轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)控外，HSF1 還可被上游轉(zhuǎn)錄因子核呼吸因子2（nuclearrespiratoty factor 2，NRF2）、轉(zhuǎn)錄因子Ying-Yang1（YY1）和轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）上調(diào)。致癌基因Notch1 能夠劫持細胞的應(yīng)激系統(tǒng)，引發(fā)HSF1 的表達。MiR-644a 可通過調(diào)節(jié)HSF1 mRNA的穩(wěn)定性下調(diào)HSF1 的表達[19]。

由于HSF1 的高表達與疾病的惡化相關(guān)，且HSF1 在腫瘤的起始、促進和進展中的作用。HSF1可能成為人類癌癥的潛在治療靶點及判斷預(yù)后的生物標志物，同時用來評估癌癥患者的預(yù)后。一些臨床前研究揭示了小分子HSF1 抑制劑的抗腫瘤活性[20]。同時，HSF1 基因消融在正常細胞和動物基礎(chǔ)生理條件下具有良好的耐受性。HSF1 對正常細胞和惡性細胞依賴性的差異可以作為一種有效的癌癥治療策略。盡管目前可用的熱休克轉(zhuǎn)錄因子（HSF）抑制劑缺乏特異性，但對HSF1 調(diào)控不斷加深了解，加上藥物發(fā)現(xiàn)的進展，將有助于開發(fā)更有效和更特異的HSF1 抑制劑。隨著對HSF1 活化和衰減復(fù)雜機制的認識不斷擴大及新技術(shù)的發(fā)展，更特異的靶向、更強效和更有選擇性的HSF1 抑制劑可能在未來幾年被開發(fā)出來[21]。

影響cSCC 預(yù)后的因素眾多[22]，本試驗探討了HSF1 在cSCC 中的表達，與臨床病理特征的關(guān)系及和cSCC 術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，提示HSF1 的陽性表達與cSCC 的腫瘤最大直徑、分化程度、侵襲性轉(zhuǎn)移相關(guān)，推斷其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用，可為cSCC 的診療提供理論參考，為腫瘤的預(yù)后提供證據(jù)。HSF1 表達與腫瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)性，腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)原因復(fù)雜。

同時，因HSF1 是cSCC 發(fā)展的重要參與者，本研究下一步將增加樣本量并進行分子機制的探討和研究，為cSCC 相關(guān)靶向藥物的研發(fā)提供更堅實的理論基礎(chǔ)，為老年cSCC 患者的治療提供更多選擇。