許牧 鄢毅 吳志圣 王志劍 朱夢葉

神經(jīng)病理性疼痛是慢性疼痛，在臨床較為常見，誘發(fā)因素為軀體感覺系統(tǒng)的疾病或損傷，對患者精神、睡眠及生活質(zhì)量造成嚴(yán)重不良影響，給家庭及社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)[1]?，F(xiàn)階段，藥物治療是主要方法，主要包括三環(huán)類抗抑郁藥、抗癲癇藥、阿片類等藥物[2]。但是，從總體上來說，這些藥物缺乏理想的治療效果，同時伴一定程度的不良反應(yīng)[3-4]。神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，神經(jīng)損傷后繼發(fā)的神經(jīng)源性炎癥是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的重要機(jī)制之一。既往研究表明，脊神經(jīng)損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化并釋放白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子，從而促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[5-6]。傳統(tǒng)中藥正清風(fēng)痛寧主要藥用成分為鹽酸青藤堿，臨床主治風(fēng)濕與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[7-9]，具有良好的抗炎及調(diào)節(jié)免疫的作用，已證實在多種炎癥疼痛中發(fā)揮良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。青藤堿可以抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞合成白細(xì)胞介素-8（IL-8）和IL-1β[10]。筆者認(rèn)為神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制與青藤堿的作用機(jī)制有高度重疊，推測其針對神經(jīng)病理性疼痛應(yīng)有治療效果，具有無明顯副作用的優(yōu)勢，用于神經(jīng)病理性疼痛的治療有明顯的優(yōu)勢。本研究通過建立神經(jīng)病理性疼痛動物模型，通過應(yīng)用行為學(xué)、分子生物學(xué)等多種實驗方法，為進(jìn)一步研究其機(jī)理提供依據(jù)，并為傳統(tǒng)中藥正清風(fēng)痛寧開發(fā)新用途和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：30 只C57BL/6 雄性小鼠，6～8 周齡，20～30 g。實驗試劑：取適量正清風(fēng)痛寧（生產(chǎn)廠家：湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z10980043，規(guī)格：20 mg），在室溫下生理鹽水充分溶解，得到正清風(fēng)痛寧實驗用液（4 mg/mL）。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)病理性疼痛小鼠模型的建立及分組 取30 只20～30 g 雄性C57BL/6 小鼠，將其隨機(jī)分成3組，實驗組[建模后給予鼻飼40 mg/（kg·d）正清風(fēng)痛寧]、模型對照組（建模后給予鼻飼生理鹽水0.2 mL/d）、假手術(shù)組（在小鼠身上開切口，未真正進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后給予鼻飼生理鹽水0.2 mL/d）。三組小鼠術(shù)前術(shù)后均正常飼養(yǎng)。建模過程：用異氟醚對其進(jìn)行麻醉后，于小鼠右側(cè)股段高位將皮膚切開，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)干，在坐骨神經(jīng)干上用7-0 尼龍絲線結(jié)扎3次，間隔1 mm，結(jié)扎完后將坐骨神經(jīng)解剖學(xué)歸位，逐層縫合至皮膚，該過程在無菌操作下進(jìn)行。小鼠術(shù)后均用單籠飼養(yǎng)。若小鼠術(shù)后出現(xiàn)下肢癱瘓、運動障礙或死亡，則需剔除，更換新的小鼠進(jìn)行建模，建模成功的標(biāo)準(zhǔn)為小鼠有自發(fā)痛、觸發(fā)痛、痛覺過敏，感覺減退和感覺倒錯等。三組鼻飼給藥，于術(shù)后第3 天開始給藥，連續(xù)給藥至術(shù)后第14 天。

1.2.2 小鼠機(jī)械縮足反射閾值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）測定 術(shù)前及術(shù)后1、3、5、7、10、14 d 均需測定小鼠PWMT，對比分析各組小鼠PWMT。檢測方法：采用Von-Frey 觸覺測痛儀對小鼠PWMT 進(jìn)行評估。將待測小鼠放進(jìn)鏤空的金屬籠子中20～30 min 使其充分適應(yīng)環(huán)境，之后采用Von-Frey 觸覺測痛儀對小鼠建模側(cè)后跖中部進(jìn)行刺激，采用Up and down 方法，即克數(shù)遞減或遞增的方式進(jìn)行測試，每次持續(xù)6～8 s，重復(fù)10次，每2 次測試間隔應(yīng)在15 s 以上。陽性標(biāo)準(zhǔn)為10 次檢測中有5 次及以上舔爪反應(yīng)或縮爪反應(yīng)出現(xiàn)，縮爪閾值為陽性反應(yīng)的最小克數(shù)。

1.2.3 小鼠熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）測定 采用足底熱輻射熱檢測儀評估術(shù)前及術(shù)后1、3、5、7、10、14 d小鼠PWTL，運用Hargreaves法，應(yīng)用鹵鎢燈發(fā)出的輻射刺激小鼠后跖，小鼠熱痛閾為小鼠舔足掌、縮爪或跳開的時間。測定過程中，在升高的半透明有機(jī)玻璃籠中放置小鼠，有機(jī)玻璃籠規(guī)格為20 cm×20 cm×25 cm，適應(yīng)環(huán)境約30 min，控制室溫在（24±2）℃，保持環(huán)境安靜。應(yīng)用50 W，8 V燈泡發(fā)出的輻射熱對小鼠患側(cè)后跖進(jìn)行照射，每只5次，計算平均值。將照射時間上限值預(yù)先設(shè)定為20 s，以有效避免灼傷小鼠足底皮膚。

1.2.4 術(shù)后14 d 檢測IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥介質(zhì) 術(shù)后14 d 處死各組小鼠，采取各組小鼠脊髓腰骶膨大處組織勻漿，通過ELISA 雙抗體夾心法檢測IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子水平，具體操作按所購NeoBioscience 公司ELISA 試劑盒說明書步驟進(jìn)行。開始實驗前20 min 從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。取出足夠數(shù)量的平衡至室溫的酶標(biāo)包被板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白孔、待測標(biāo)本孔。將100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔中，先將標(biāo)本（大鼠脊髓腰骶膨大處組織勻漿）100 μL 加入待測標(biāo)本孔中；空白孔不加。用封板膠紙將各孔封住，在37 ℃恒溫箱中孵育1.5 h。洗板5 次。將100 μL 生物素化抗體工作液加入每孔，將生物素化抗體稀釋液加入空白孔，將各孔封住。在37 ℃恒溫箱孵育1 min。重復(fù)洗板5 次。將100 μL 酶結(jié)合物工作液加入各孔，將酶結(jié)合物稀釋液加入空白孔，封板，在37 ℃恒溫箱避光孵育30 min，洗板5 次。將100 μL 顯色底物加入每孔，在37 ℃恒溫箱避光孵育15 min。將100 μL 終止液加入各孔，混勻后采用酶標(biāo)儀對CD450 值進(jìn)行即刻測量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，行為學(xué)比較采用重復(fù)測量方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠PWMT 比較 分別在術(shù)前及術(shù)后1、3、5、7，10、14 d 檢測各組小鼠的PWMT。從CCI 術(shù)后1 d 開始，模型對照組小鼠的PWMT 明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）。相比于模型對照組，術(shù)后第3 天起給予正清風(fēng)痛寧40 mg/（kg·d）后，從術(shù)后7 d起實驗組小鼠的PWMT 明顯升高（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 三組小鼠PWMT比較（n=10）

表1 三組小鼠PWMT比較[g，（）]

表1 三組小鼠PWMT比較[g，（）]

※與假手術(shù)組比較，P＜0.05；＃與模型對照組比較，P＜0.05。

2.2 三組小鼠PWTL 比較 分別在術(shù)前及術(shù)后1、3、5、7、10、14 d 檢測各組小鼠的PWTL。從CCI術(shù)后1 d 開始，相比于假手術(shù)組，模型對照組小鼠的PWTL 明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。相比于模型對照組，術(shù)后第3 天起給予正清風(fēng)痛寧40 mg/（kg·d）后，從術(shù)后7 d 起實驗組小鼠的PWTL 明顯延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 三組小鼠PWTL比較（n=10）

表2 三組小鼠PWTL比較[s，（）]

表2 三組小鼠PWTL比較[s，（）]

※與假手術(shù)組比較，P＜0.05；＃與模型對照組比較，P＜0.05。

2.3 三組小鼠脊髓組織炎癥因子水平比較 Elisa檢測各組小鼠脊髓中炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表達(dá)水平。模型對照組小鼠脊髓中的TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。相比于模型對照組，實驗組小鼠脊髓中TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 三組小鼠脊髓組織炎癥因子水平比較（n=10）

表3 三組小鼠脊髓組織炎癥因子水平比較[pg/mL，（）]

表3 三組小鼠脊髓組織炎癥因子水平比較[pg/mL，（）]

3 討論

正清風(fēng)痛寧主要成分為青藤堿，是從防己科植物青風(fēng)藤和毛青藤中提取出來的，屬于一種生物堿，具有通絡(luò)、止痛、祛風(fēng)濕之功效，臨床上對于治療腰椎疾病、頸椎疾病、漏肩風(fēng)病及骨關(guān)節(jié)炎等均有比較明顯的療效[11]。中醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用青風(fēng)藤或其復(fù)方治療風(fēng)濕性疾病已有一千多年的歷史。早在宋朝《圖經(jīng)本草》和明朝《本草綱目》上記載：“青風(fēng)藤主治風(fēng)疾，治風(fēng)濕流注，歷節(jié)鶴膝，麻痹瘙癢，損傷瘡腫入，藥酒中用”[12]?！侗静輩R言》記載“青風(fēng)藤散風(fēng)寒濕痹之藥也，能舒筋活血，正骨利髓，故風(fēng)病軟弱無力，并勁強偏廢之證，久服常服，大建奇功”[13]。根據(jù)中醫(yī)關(guān)于“痹癥”的病因機(jī)制和中藥關(guān)于青藤堿性溫味苦、氣平、無毒，有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、利水止痛的功效論述，采用青藤堿治療風(fēng)濕類疼痛效果明顯[14]。

近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)的不斷發(fā)展，對于正清風(fēng)痛寧（青藤堿）的藥物作用機(jī)制有著越來越深入的了解。有研究證實其有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤及鎮(zhèn)痛作用[15]。青藤堿可以通過調(diào)節(jié)Treg 與Th17 細(xì)胞的平衡，影響炎癥因子的合成，有效改善膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型的癥狀[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549 凋亡，抑制其侵襲[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿能夠抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能是通過抑制COX-2 表達(dá)，從而影響血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)和釋放[18]。目前對于青藤堿的免疫調(diào)節(jié)、抗炎及抗腫瘤作用，國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報道，但對于青藤堿抑制疼痛及其相關(guān)機(jī)制報道甚少。有研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿在小鼠糖尿病性神經(jīng)痛模型中可抑制脊髓背根神經(jīng)節(jié)P2X3 受體的上調(diào)表達(dá)和活化，減輕大鼠中P38MAPK 活化而增強的痛覺過敏[19]。另外有研究證實，青藤堿誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛作用的另一種解釋是阻滯酸敏感離子通道和L 型鈣通道，可以減少與疼痛相關(guān)信號神經(jīng)元的激活。此外，有關(guān)研究指出，青藤堿對小膠質(zhì)細(xì)胞的活化具有抑制作用[20]。同時青藤堿可改善慢性疼痛后繼發(fā)抑郁行為。這些研究均提示青藤堿可能對神經(jīng)病理性疼痛的外周及中樞免疫反應(yīng)可能具有良好的調(diào)控作用，同時有改善慢性疼痛后繼發(fā)焦慮情緒的可能。

目前已有臨床及基礎(chǔ)研究證實，青藤堿可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及脊髓背根神經(jīng)節(jié)P2X3 受體的上調(diào)表達(dá)和活化，且長期使用無明顯耐藥性[21]。以上均提示正清風(fēng)痛寧對神經(jīng)病理性疼痛的外周及中樞免疫反應(yīng)可能具有良好的調(diào)控作用。在本研究中，筆者建立小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，通過正清風(fēng)痛寧觀察其治療小鼠神經(jīng)病理性疼痛，實驗結(jié)果表明正清風(fēng)痛寧可以改善CCI 致小鼠神經(jīng)病理性疼痛，并減少小鼠脊髓炎癥因子表達(dá)水平，其緩解疼痛的機(jī)制可能與下調(diào)炎癥因子相關(guān)。正清風(fēng)痛寧治療神經(jīng)病理性疼痛仍需更多的基礎(chǔ)及臨床試驗，進(jìn)一步驗證其在神經(jīng)病理性疼痛中的應(yīng)用。