薛玉洋 孫浩彬 王銀玲 李佳橙 劉保倉,2 韓 坤,2 齊亞銀 陳 程* 張文舉*

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832003；2.新疆泰昆集團昌吉飼料有限責任公司，昌吉 831199)

纖維是反芻動物的主要能量來源[1]，是構成細胞壁的主要成分。由于其復雜的結合形式，限制了胞內營養(yǎng)物質的降解，導致營養(yǎng)物質大量排泄和細胞壁部分不完全利用，在理想飼喂條件下，其降解率仍不超過65%。因此，為降解細胞壁釋放胞內營養(yǎng)物質，提高飼料利用率，研究人員提出過許多方法，如添加不同的化學物質(氫氧化鈉、尿素等)、粉碎揉碎原料、進行生物處理等，但結果都不能達到需求。吳爽[2]研究表明，在飼糧中添加外源纖維復合酶可有效提高反芻動物的采食量和飼料轉化率，且添加外源纖維復合酶可提高底物可發(fā)酵部分，改善瘤胃發(fā)酵；另有研究表明添加外源纖維復合酶可降低腸道食糜黏度，提高纖維消化率[3]，釋放出可支持有益于微生物區(qū)系的低聚糖，同時抑制致病菌增殖[4]。因此，添加外源復合非淀粉多糖酶制劑(來自具有高纖維素和半纖維素活性的真菌、細菌)是提高動物能量利用率和生產(chǎn)性能的有效途徑之一。將其以液體或顆粒形式與飼糧、干草、青貯、精料等飼料混合，可破解細胞壁，從而釋放更多營養(yǎng)物質，提高飼料的消化率[5]。本試驗通過體外發(fā)酵法研究外源非淀粉多糖酶的最適配比及對體外發(fā)酵的綜合影響效果，探討外源復合非淀粉多糖酶的營養(yǎng)調控作用，為外源酶制劑在生產(chǎn)中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及供體動物

試驗所用非淀粉多糖酶制劑均由山東某酶制劑有限公司提供。4種酶制劑纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶的菌種來源為里氏木霉，標識酶活分別為300 000、300 000、50 000和50 000 U/g。其他試劑除特殊說明外，均為分析純，水均為符合GB/T 6682-2008中規(guī)定的二級水。

在石河子大學動物試驗站選取6只60日齡的羊作為瘤胃液供體羊。基礎飼糧根據(jù)NRC(2004)日增重100 g肉羊的營養(yǎng)需要量配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

續(xù)表1項目 Items含量 Content粗脂肪 EE2.82粗蛋白質 CP18.94中性洗滌纖維 NDF19.21酸性洗滌纖維 ADF10.26鈣 Ca0.66磷 P0.44消化能 DE/(MJ/kg)12.40

1.2 試驗設計

1.2.1 模擬瘤胃條件下單酶活性測定

酶活測定采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法，分光光度計(精科721G，上海)540 nm處測量吸光度值。纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶活性測定所用底物分別為羧甲基纖維素鈉、小麥粉木聚糖(可溶性)和小麥粉木聚糖(不可溶性)、葡聚糖、甘露聚糖。

本試驗中酶活定義為：在39 ℃、pH 6.5條件下，每分鐘從1 mg/mL溶液中釋放1 μmoL還原糖所需酶量，即定義為1個酶活單位(U)。

1.2.2 單酶最適添加量的體外篩選

采用單因素完全隨機試驗設計，將4種酶按照在飼糧中的添加量分別設定7個水平(0、50、125、250、750、1 000、2 000 U/g，干物質基礎)，每個水平設3個重復，添加到飼糧中，模擬瘤胃體外消化試驗，培養(yǎng)12 h，并記錄12 h累積產(chǎn)氣量(GP)及干物質降解率(DMD)。

1.2.3 復合酶酶譜的體外篩選

根據(jù)單酶最適添加量的體外篩選試驗結果，將纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶再設計3個梯度。按照三元正交表中L9(34)設計9組復合酶配比，進行體外瘤胃消化試驗。記錄不同時間段(2、6、8、12、24、36、48 h)的GP及發(fā)酵48 h后pH、DMD。采用正交試驗極差分析方法，求出體外酶解反應中pH、平均GP和DMD提高率3個指標下4種酶的主次順序，并得出最佳配比。

表2 試驗因素與水平

表3 正交設計試驗方案

1.2.4 外源復合非淀粉多糖酶對瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

根據(jù)復合酶酶譜的體外篩選試驗結果，確定4種酶最佳配比為纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶為∶甘露聚糖酶=1 000∶250∶500∶50(U/g，干物質基礎)。再設定2組，分別為對照組(基礎飼糧)和試驗組(基礎飼糧+復合酶)。每組設置24個玻璃注射器。培養(yǎng)至2、4、6、8、12、24、48 h，隨機取3個注射器快速讀取活塞所處刻度值并測定pH，用冰水終止反應，抽取發(fā)酵液用低溫離心機(4 ℃，5 400 r/min，10 min)離心，取上清液-20 ℃條件下保存，用來測定總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸(acetic acid)、丙酸(propionic acid)、丁酸(butyric acid)的濃度、氨態(tài)氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)的含量，并計算乙丙比(A/P)；將玻璃注射器內的濾袋取出，沖洗干凈后，105 ℃烘干，稱重，用來測定發(fā)酵后DMD。

1.3 體外發(fā)酵及樣品采集

晨飼前采集瘤胃內容物，裝于提前預溫并充滿CO2的保溫瓶中，用4層紗布過濾在預熱39 ℃的容器中并持續(xù)通CO25 min。整個操作于39 ℃水浴中進行。按照試驗設計，在飼糧中加入相應的酶，混合均勻。根據(jù)Menke等[6]的方法將瘤胃液與人工培養(yǎng)液以1∶2的體積混合制成人工瘤胃液，每個注射器中加入200 mg飼糧和30 mL人工瘤胃液后，迅速放入39 ℃恒溫振蕩水浴箱中。

1.4 測定指標及測定方法

發(fā)酵液用pH計(力辰科技筆式酸度計pH-10，上海)測定；NH3-N濃度使用比色法測定[7]；MCP濃度采用試劑盒(北京全式金生物技術公司)使用全波長酶標儀(Multiskan GO，美國)測定，測定方法按照試劑盒說明書進行；揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度采用液相色譜儀(Agilent 1100，美國)測定[8]。發(fā)酵殘渣在105 ℃烘箱中烘12 h至恒重后測定干物質含量。

DMD(%)=[(樣本干物質重-殘渣干物質重+
空白干物質重)/樣本干物質重]×100。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理后，采用SPSS 19.0軟件對單酶添加量進行單因素方差分析，復合酶酶譜的體外篩選試驗進行正交極差分析，外源復合非淀粉多糖酶體外發(fā)酵試驗采用一般線性模型進行方差分析，試驗結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示。采用Duncan氏法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 模擬瘤胃條件下單酶活性測定結果

模擬瘤胃(39 ℃，pH 6.5)條件下測得的纖維素酶、木聚糖酶(底物為可溶性)、木聚糖酶(底物為不可溶性)、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶的活性分別為18 000、76 000、100 000、61 000、30 000 U/mL。

2.2 單酶最適添加量的體外篩選

4種單酶不同添加量對GP和DMD的影響分別見圖1、圖2。由圖可知，GP和DMD均隨纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶添加量的增加呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。根據(jù)表6中差異顯著性分析結果判斷出單酶最適添加量。

根據(jù)圖1、圖2和表6得出，纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶體外發(fā)酵GP最優(yōu)的添加量分別為750、125、750、125 U/g；對DMD最優(yōu)的添加量分別為125、125、750、125 U/g。綜合GP和DMD 2個指標，確定飼糧在體外發(fā)酵時各單酶的最佳添加量為纖維素酶750 U/g、木聚糖酶125 U/g、葡聚糖酶750 U/g、甘露聚糖酶125 U/g。

2.3 外源復合非淀粉多糖酶酶譜的體外篩選

不同配比的非淀粉多糖酶對瘤胃體外發(fā)酵的pH、GP和DMD的影響如表7所示。采用正交試驗極差法得出，4種單酶對pH的影響主次順序依次為纖維素酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶，最佳組合配比為A3B1C1D3；4種單酶對GP的影響主次順序依次為纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶，最佳組合配比為A3B3C1D2；4種單酶對DMD的影響主次順序依次為木聚糖酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶，最佳組合配比為A3B3C1D3；

圖1 4種單酶不同添加量對體外GP的影響

圖2 4種單酶不同添加量對體外DMD的影響

根據(jù)pH、GP和DMD這3項指標的極差分析的試驗結果，最終以編號為9的組合A3B3C1D1[纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶∶甘露聚糖酶=1 000∶250∶500∶50(U/g，干物質基礎)]為最優(yōu)配比。

2.4 外源復合非淀粉多糖酶對瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

外源復合非淀粉多糖酶對瘤胃體外發(fā)酵特性的影響見表8。與對照組相比，試驗組48 h 平均DMD極顯著升高6.67%(P<0.01)，處理和發(fā)酵時間對平均DMD均有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，在48 h內，隨著發(fā)酵時間的延長，DMD隨之增加，且試驗組均不同程度高于對照組，至48 h時，試驗組DMD與對照組相似。試驗組平均GP高出對照組5.69 mL(P<0.01)，處理和發(fā)酵時間對平均GP均有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，在48 h內，隨著發(fā)酵時間的延長，GP隨之增加，且試驗組均不同程度高于對照組。

表6 4種單酶體外消化對GP和DMD的影響

圖3 不同配比外源復合非淀粉多糖酶對GP的影響

試驗組平均NH3-N濃度高出對照組2.57 mg/dL(P<0.01)，處理和發(fā)酵時間對平均NH3-N濃度有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，0～8 h，試驗組NH3-N濃度不同程度高于對照組，12～24 h，試驗組NH3-N濃度與對照組相似。試驗組平均MCP濃度較對照組低2.16 mg/dL(P>0.05)，處理對平均MCP濃度有顯著影響的趨勢(0.05

圖4 不同配比外源復合非淀粉多糖酶對DMD的影響

表7 外源復合非淀粉多糖酶酶譜篩選結果

試驗組平均TVFA濃度比對照組高2.44 mmol/L(P<0.05)，處理對平均TVFA濃度無顯著影響(P>0.05)，但發(fā)酵時間對平均TVFA濃度有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，TVFA濃度整體呈現(xiàn)升高的趨勢，在0～8 h，試驗組的TVFA濃度高于對照組，在12～24 h，試驗組的TVFA濃度低于對照組。試驗組平均乙酸濃度與對照組無顯著差異(P>0.05)，處理對平均乙酸濃度無顯著影響(P>0.05)，發(fā)酵時間對平均乙酸濃度有極顯著影響(P<0.01)，二者互作效應不顯著(P>0.05)。由圖5可以看出，對照組與試驗組的乙酸濃度變化趨勢一致。試驗組平均丙酸與丁酸濃度極顯著高于對照組(P<0.01)，處理和發(fā)酵時間對平均丙酸與丁酸濃度均有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，在0～8 h，試驗組的丙酸和丁酸濃度高于對照組；在12～48 h，試驗組的丙酸和丁酸濃度低于對照組。試驗組平均A/P極顯著低于對照組(P<0.01)，處理和發(fā)酵時間對平均A/P均有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應極顯著(P<0.01)。由圖5可知，隨著發(fā)酵時間的延長，對照組與試驗組A/P變化趨勢不一致，在2～4 h，各試驗組的A/P低于對照組，在6～48 h，對照組與試驗組A/P趨于相等。

表8 外源復合非淀粉多糖酶對瘤胃體外發(fā)酵特性(平均值)的影響

續(xù)表8項目Items對照組 Control group試驗組 Test groupSEMP值 P-value處理 Treatment發(fā)酵時間 Fermentation time互作效應Interaction effect丁酸 Butyric acid/(mmol/L)5.50B6.41A0.122<0.001<0.001<0.001乙丙比 A/P2.84A2.48B 0.024<0.001<0.001<0.001總揮發(fā)性脂肪酸 TVFA/(mmol/L)53.3955.831.1190.134<0.0010.001

圖5 外源復合非淀粉多糖酶對瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

3 討 論

3.1 單酶添加量對瘤胃體外發(fā)酵GP和DMD的影響

同一種試驗動物，所用酶制劑的添加量不同產(chǎn)生的效果也不同[9-10]。對于酶制劑添加量的高低，并沒有統(tǒng)一的標準來衡量。因為酶的添加量需要綜合酶的活性、底物和環(huán)境等來確定。而酶的活性受多種因素的影響，如酶的來源、濃度、作用的底物及溫度、pH等。Sakita等[9]的研究從里氏木霉中提取纖維分解酶，設置了5個劑量(0、5、50、500和5 000 μL)，探究其對不同底物的影響，結果表明，高劑量組的DMD、中性洗滌纖維降解率(DNFD)顯著高于其他組。Abid等[11]利用瘤胃中的長柄木霉產(chǎn)生的纖維分解酶在體外降解橄欖葉，設置了0、1、2和4 μL/g(干物質基礎)4個添加量，結果表明中添加量的纖維分解酶可增加GP、DMD、MCP濃度，而高添加量的纖維分解酶對GP、DMD無顯著影響，且導致MCP濃度降低。在本研究中，針對特定底物，對選用的4種酶均設置了7個添加量，結果顯示，各酶處理的GP和DMD均隨添加量的增加而升高，當超出一定水平時，則表現(xiàn)出不增加或呈現(xiàn)下降趨勢，說明隨酶添加量的增加加速了底物反應，在達到一定值后，GP和DMD受底物限制，趨于平緩。在實際應用中，酶添加量并非越高越好，前人研究顯示酶添加過量會降低營養(yǎng)物質消化率[12]。Arif等[13]研究表明，酶添加過量時，底物被酶解效果下降，這與Parwiyanti等[14]的研究結果一致。因此，本試驗以GP和DMD為指標進行綜合評價，當纖維素酶為750 U/g、木聚糖酶為125 U/g、葡聚糖酶為750 U/g、甘露聚糖酶為125 U/g(均為干物質基礎)時，各酶分別發(fā)揮出最佳水平。通過與底物的反應選出各酶的最適添加量，為下一步進行4種酶的復合配比奠定基礎。

3.2 不同復合酶酶譜對瘤胃體外發(fā)酵GP和DMD的影響

由于飼糧中底物成分復雜，運用單酶進行復合配比后產(chǎn)生協(xié)同作用，效果通常要優(yōu)于單一酶制劑[15]。在使用復合酶制劑時應把握好各單酶間的相互作用，發(fā)掘不同單酶之間的協(xié)同作用，同時降低拮抗作用。有研究表明，復合酶的不同添加量對GP、DMD及瘤胃發(fā)酵參數(shù)等的影響不一致[16]。Malathi等[5]的研究表明，對于不同的底物，不同的復合酶所產(chǎn)生的效果不一致。酶具有專一性，要根據(jù)底物的不同來調節(jié)酶的添加量，使其發(fā)揮出更好的效果。張順芬等[17]探究了不同外源酶組合對2種不同來源棕櫚粕的體外降解特性的影響，結果表明，不同外源酶組合極顯著地影響了棕櫚粕的體外干物質消化率、粗蛋白質消化率和能量消化率。劉匯濤等[18]的研究表明，在飼糧中添加不同配比及添加量的復合酶制劑對飼糧的改善效果不一致，其中添加890 mg/kg復合酶制劑Ⅰ時，育成期水貂生長性能、營養(yǎng)物質消化率和氮代謝均明顯提高，并由此推測，造成該結果的原因可能為不同配比的復合酶制劑對內源酶的影響不同。本試驗結果顯示，4種酶的配比為纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶∶甘露聚糖酶=1 000∶250∶500∶50(U/g，干物質基礎)時，效果最佳。上述研究結果與本試驗結果都表明，不同添加量和種類的外源酶，其適宜配比為提升飼料中營養(yǎng)物質消化吸收作用的關鍵[19]，將外源酶配比使用時互補作用更明顯，其對飼料中營養(yǎng)物質消化率的提升效果也更明顯。

3.3 外源復合非淀粉多糖酶對瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

3.3.1 外源復合非淀粉多糖酶對瘤胃體外發(fā)酵GP和DMD的影響

GP為第一指標，因為產(chǎn)氣率與底物降解率成正比，是評估底物降解的簡單篩選工具[6]，是衡量瘤胃中可發(fā)酵物質的含量、微生物活性強弱的重要指標之一[6,20]。GP越高，飼糧的發(fā)酵強度越大[21]。DMD主要用于評價飼料營養(yǎng)價值，DMD越高，說明飼料中營養(yǎng)物質利用更充分[22]。

有研究表明，在飼料中添加外源纖維酶，其發(fā)酵過程有利于GP的提高[23]。此外，Colombatto等[24]和Wang等[25]報道，在飼糧中添加外源纖維酶有利于營養(yǎng)物質釋放，促進瘤胃發(fā)酵，提高底物的降解率，后經(jīng)瘤胃微生物作用產(chǎn)生能量和VFA以供動物吸收利用，從而提高DMD。本試驗結果表明，試驗組的GP高于對照組，隨著發(fā)酵時間延長，各組產(chǎn)氣速率均減緩，但試驗組發(fā)酵后期GP在數(shù)值上仍高于對照組。體外培養(yǎng)48 h后，試驗組的平均DMD極顯著高于對照組。這可能是因為添加外源復合非淀粉多糖酶使細胞壁破解，部分難消化利用的纖維類物質被降解為利于消化吸收的單糖、寡糖等小分子物質，從而提高飼料的利用率，與王紅梅[26]的研究結果相似。

3.3.2 外源復合非淀粉多糖酶對瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃pH是反芻動物瘤胃發(fā)酵最直觀的反映和基本指標，其正常范圍為5.4～7.5[27]。本研究中各組發(fā)酵液pH為6.25～6.40，均在正常范圍，且試驗組與對照組間無顯著差異，說明添加外源復合非淀粉多糖酶對體外瘤胃內環(huán)境未造成不良影響。

反芻動物瘤胃中NH3-N是瘤胃微生物降解飼料中蛋白質、氨基酸等含氮成分產(chǎn)生的，是合成MCP的重要原料，也是反映反芻動物氮代謝的主要指標，綜合反映了瘤胃內氮代謝的過程[28]。Murphy等[28]的研究表明，瘤胃中NH3-N濃度正常范圍是6.3～27.5 mg/dL，過高或過低都對動物機體不利，過高說明氮產(chǎn)生量大于利用量，易造成氨中毒，過低說明MCP的合成率降低即微生物活性降低[29-30]。在本試驗中，試驗組和對照組各時間點的NH3-N濃度均在正常范圍內，說明添加外源復合非淀粉多糖酶不會影響瘤胃氮利用率。但8 h前試驗組NH3-N濃度均大于對照組，可能是因為添加外源復合非淀粉多糖酶后加速了瘤胃中降解蛋白質的菌群的增殖，增強了固定分子氮的能力；還可能是因為在模擬瘤胃體外發(fā)酵過程中沒有瘤胃壁對NH3-N的吸收環(huán)節(jié)，導致其在培養(yǎng)管中累積[31]。因此，在8 h前試驗組NH3-N濃度比對照組高?？傮w上看，NH3-N濃度的升高表明對底物利用率提高。

瘤胃微生物可將碳水化合物降解為VFA、二氧化碳(CO2)和甲烷(CH4)等，大部分VFA則通過瘤胃壁擴散進入血液，為動物機體提供60%～80%的能量，也是其能量和碳的主要來源[32]。其中，碳原子含量不同，吸收速度也不同，吸收速度為丁酸>丙酸>乙酸[33]。有研究表明，A/P>3時為乙酸發(fā)酵，反之，則為丙酸發(fā)酵。本試驗中，整個發(fā)酵過程中試驗組丙酸、丁酸濃度均高于對照組，且在4 h前，試驗組丙酸、丁酸濃度遠超出對照組，A/P則低于對照組，而后，對照組與試驗組趨于一致。Wang等[34]和國春艷[31]的研究表明，添加外源纖維素酶后，試驗組丙酸濃度增加，瘤胃發(fā)酵類型轉變?yōu)楸岚l(fā)酵。而本試驗中，在體外培養(yǎng)前對底物進行了24 h預處理，使得外源復合非淀粉多糖酶能夠直接作用于底物，釋放還原糖，增加微生物對底物的附著能力，從而說明添加外源復合非淀粉多糖酶增加了瘤胃內碳水化合物的降解利用，能夠在前期提高培養(yǎng)液中的丙酸和丁酸濃度，改變發(fā)酵類型，但作用時間不長，其原因可能是預處理加速了外源復合非淀粉多糖酶破解植物細胞壁，促進了降解產(chǎn)物寡糖的發(fā)酵，加快了飼料的利用，這與Malathi等[5]的研究結果相似。

MCP作為反芻動物最主要的氮源供應者，能為動物機體提供所需要蛋白質的40%～90%[35]。瘤胃液中MCP的合成需要提供一定的能量、氮源及其他營養(yǎng)成分。本試驗中，在12和24 h時，試驗組MCP濃度低于對照組，其他時間2組差異不顯著。12和24 h時，試驗組丙酸和丁酸濃度也遠低于對照組，但NH3-N濃度無顯著差異，推斷這由于能量和氮利用率之間的不同步造成的。Elghandour等[23]研究外源纖維復合酶處理4種不同纖維飼料時發(fā)現(xiàn)，各組除了MCP濃度下降外，GP、DMD、VFA濃度均增加。這與本試驗結果一致，進一步說明了添加外源復合非淀粉多糖酶促進了飼糧的發(fā)酵。

4 結 論

① 綜合試驗結果，在本試驗所用飼糧和體外條件下，外源復合非淀粉多糖酶最適添加量及配比為纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶∶甘露聚糖酶=1 000∶250∶500∶50(U/g，干物質基礎)。

② 添加適宜配比的外源非淀粉多糖酶可以提高瘤胃體外DMD和GP，改善瘤胃發(fā)酵功能。